论文部分内容阅读
目的:通过实验研究明确头穴围刺对脑梗死大鼠神经功能及脑血流的影响,阐明Wnt/β-catenin信号通路可以介导头穴围刺上调血管新生相关因子表达,促进脑梗死后血管新生的作用机制,为临床头穴围刺治疗脑梗死提供实验依据。方法:实验研究分为三部分。实验一:观察头穴围刺对大脑中动脉栓塞(MCAO)大鼠神经功能、脑梗死组织病理形态、脑梗死体积及脑梗死区皮质血液灌注量的影响。将108只雄性SD大鼠,按照随机数字表分成假手术组(Sham)、模型组(Model)和头穴围刺组(AC)3组,按照术后7天、14天、21天每个时间点再分成3组,每组12只大鼠,分别给予相应的处置或治疗。采用mNSS评分法观察各组大鼠神经功能;采用HE染色观察各组大鼠脑梗死组织病理形态学变化;TTC染色观察脑梗死体积;采用激光多普勒血流仪观察大鼠脑缺血区皮质血流量(rCBF);明确头穴围刺对MCAO大鼠行为学和形态学的影响。实验二:观察头穴围刺对MCAO大鼠脑梗死组织Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达的影响。将108只大鼠随机分成3组,分别为假手术组(Sham)、模型组(Model)和头穴围刺组(AC),根据术后7天、14天、21天时间点每组分为3个亚组,每亚组大鼠12只,分别编号并标记。再取120只大鼠随机分为假手术组(Sham)、模型组(Model)、头穴围刺组(AC)、抑制剂组(DKK1)和头穴围刺+抑制剂组(AC+DKK1),根据术后7天、14天两个时间点每组分为2个亚组,每亚组大鼠12只,分别编号并标记。分别采取相应处置。采用免疫组化法、Western blot法、RT-PCR法检测脑梗死组织内Wnt3a、β-catenin、TCF4、Cyclin D1、GSK-3β表达。明确头穴围刺对MCAO大鼠脑梗死组织Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白及基因表达的影响。实验三:观察头穴围刺对脑梗死大鼠VEGF等血管新生相关因子的影响。采用的大鼠数量及分组方法同实验二,分别采用免疫组化法、Western blot法和RT-PCR法检测VEGF、Ang2、FLK1、bFGF表达。明确头穴围刺可以促进脑梗死后血管新生相关因子表达,从Wnt/β-catenin信号通路介导血管新生相关因子上调的角度揭示头穴围刺促进脑梗死后血管新生的作用机制。结果:实验一:(1)mNSS评分结果:AC组与Model组相比在7天、14天、21天三个时间点评分均明显降低(P<0.05),AC组内7天、14天、21天三个时间点逐渐降低,21天与7天相比较下降明显(P<0.05)。(2)HE染色结果显示:Model组大鼠脑梗死组织可见明显组织疏松,结构紊乱、形态不规则,神经细胞排列不清、数目明显减少,可见微血管管腔明显变形,甚至塌陷同时胞浆淡染,胞核溶解,直至21天略有改善但并不明显;AC组较Model组三个时间点均有明显改善,梗死灶周围神经细胞数量增多,结构和形态较模型组大鼠略规则,排布趋势较模型组紧致,微血管管腔变形较少,微血管数量较模型组增多,AC组7天和14天时大鼠脑组织病理改变整体上较Model组有明显改善,21天时比Model组大鼠脑组织周围神经细胞数量增多,结构和形态规则,排布趋势紧致,微血管管腔有少量变形,微血管数量较模型组增多。(3)TTC染色观察脑梗死体积:三个时间点比较AC组比Model组脑梗死体积均明显缩小,差异显著(P<0.05),AC组内相比较21天较7天脑梗死体积缩小明显,差异显著(P<0.05),说明头穴围刺可以明显缩小脑梗死体积。(4)实验前后大鼠脑缺血区皮质血流量(rCBF)各时间点检测结果:7天、14天和21天时间点Model组rCBF实验后大鼠分别较实验前降低明显,实验后Model组各时间点的rCBF随着时间的延长增加不明显;实验后AC组大鼠rCBF随着时间的延长逐渐接近实验前,至21天实验后与实验前比较rCBF差异不明显无统计学意义(P>0.05)。实验二:(1)免疫组化法观察Wnt3a、β-catenin、TCF4、Cyclin D1和GSK-3β表达结果:针刺干预后,Wnt3a和β-catenin三个时间点表达AC组较Model组增加较明显(P<0.05,P<0.01),且高峰期持续至14天,之后21天略有下降趋势;AC组三个时间点中TCF4表达较Sham组均增加明显(P<0.05),且其蛋白表达在第7天达到高峰,之后至21天仍趋于较高水平;三个时间点中AC组Cyclin D1表达与Model组相比较差异明显(P<0.05),高峰期出现在第14天。而GSK-3β表达明显下降,AC组三个时间点较Sham组均降低明显,差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)采用Western blot法检测Wnt3a、β-catenin、TCF4、Cyclin D1和GSK-3β蛋白表达:三个时间点,Wnt3a及β-catenin的蛋白表达均为升高趋势,AC组和Model组与Sham组比较可见较明显升高,差异均具有统计学意义(P<0.01、P<0.05);TCF4和Cyclin D1蛋白表达,AC组较Model组升高,差异具有统计学意义(P<0.05);GSK-3β蛋白表达趋势相反,AC组比Model组下降,差异具有统计学意义(P<0.05);头穴围刺可以上调Wnt 3a、β-catenin、TCF4、Cyclin D1蛋白表达、降低GSK-3β蛋白表达,尤其Wnt 3a、β-catenin两种蛋白对头穴围刺更加敏感,尤其在7天和14天表达明显。在抑制剂干预之后Wnt3a和β-catenin蛋白在7天和14天两个时间点中AC+DKK1组与Model组相比升高明显(P<0.01),DKK1组与Model组相比下降明显,差异有统计学意义(P<0.01)。(3)采用RT-PCR法检测Wnt 3a、β-catenin、TCF4、Cyclin D1、GSK-3βmRNA表达:三个时间点,Wnt3a、β-catenin、TCF4、Cyclin D1 mRNA表达AC组和Model组相比均明显升高(P<0.01),而GSK-3β的表达呈逐渐降低趋势与Model组相比较下降明显,差异有统计学意义(P<0.05)。其中Wnt 3a和β-catenin mRNA表达在针刺后更加敏感尤其在第7、14天明显高于Model组。在加入抑制剂后Wnt 3a、β-catenin mRNA表达在7天和14天两个时间点中,AC+DKK1组与Model组相比较升高明显(P<0.05),DKK1组与Model组相比明显下降,差异有统计学意义(P<0.01)。实验三:(1)采用免疫组化法观察VEGF、Ang2、FLK1、b FGF的表达:AC组VEGF和Ang2表达较Sham组和Model组增加明显(P<0.01),且7天高峰期持续至14天,之后21天趋于平稳仍明显超过Sham组(P<0.01);FLK1表达,AC组较Sham组和Model组增加明显,差异具有统计学意义(P<0.01);b FGF表达在7天开始升高,Model组较Sham组升高明显(P<0.05),14天开始逐渐下降,AC组在三个时间点均高于Model组差异明显(P<0.01)。(2)采用Western blot法检测VEGF、Ang2、FLK1、b FGF表达:AC组三个时间点VEGF蛋白均较Model组和Sham组明显增高,差异明显有统计学意义(P<0.01),Ang2、FLK1、b FGF表达AC组14天时增高达到峰值较Model组和Sham组增高明显,差异有统计学意义(P<0.05),其中针刺组VEGF和Ang2蛋白表达在第7、14天表达明显升高。加入抑制剂后VEGF、Ang2蛋白表达在7天和14天两个时间点中,AC+DKK1组与Model组相比较升高明显(P<0.05),DKK1组与Model组相比下降明显,差异有统计学意义(P<0.01)。(3)采用RT-PCR法检测VEGF、Ang2、Flk1、b FGF mRNA表达:VEGF、Ang2、Flk1、b FGF mRNA表达,AC组均比Model组升高,差异有统计学意义(P<0.05),其中VEGF和Ang2 mRNA表达较明显在第7天达到峰值持续到14天,逐渐下降。加入抑制剂后,观察VEGF和Ang2 mRNA表达,7天和14天两个时间点AC+DKK1组比Model组中表达明显升高(P<0.01),DKK1组与Model组相比降低明显(P<0.05)。结论:1.头穴围刺能够降低脑梗死大鼠神经功能缺损程度,减少脑梗死体积,增加脑梗死区血液流灌量,恢复脑梗死大鼠神经功能;2.头穴围刺可以上调Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白,激活下游血管新生因子表达;3.头穴围刺能够上调血管新生相关因子的蛋白表达,促进梗死区微血管生成,改善梗死区微循环状态;4.头穴围刺通过对Wnt/β-catenin信号通路的调控作用促进血管新生相关蛋白的表达,从而促进血管新生,降低脑梗死大鼠损伤程度。