金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是自然界中广泛存在的一种重要的病原菌，可引起许多严重感染，属于革兰氏阳性菌。环二腺嘌呤核苷酸(c-di-AMP)是革兰氏阳性菌中广泛存在的第二信使分子，对于细菌胞内钾离子运输，脂肪酸合成，细胞壁的稳态及生物被膜的形成等都具有重要的调控作用。细菌胞内c-di-AMP的合成和降解分别受二腺苷酸环化酶(diadenylate cyclase，DAC)及磷酸二酯酶(phosphodiesterase，PDE)的调控。目前己知的降解c-di-AMP的磷酸二酯酶根据结构域可分为两类:(1)DHH-DHHA1结构域蛋白，包括OdpP及其同源蛋白以及Rv2837c类独立的DHH-DHHA1单结构域蛋白。(2)HD类催化结构域蛋白，其中OdpP类以及HD类PDE可将c-di-AMP降解成pApA，而只有Rv2837c类PDE可继续降解pApA为AMP。本论文主要内容为金黄色葡萄球菌中参与降解c-di-AMP的磷酸二酯酶GdpP的蛋白结构与功能研究。　　GdpP是第一类被鉴定出的能降解c-di-AMP的磷酸二酯酶，存在于多种革兰氏阳性菌中，在敲除GdpP的菌株中能检测到胞内c-di-AMP水平的显著增加。GdpP N端具有两个穿膜区，随后是一个PAS(Per-Arnt-Sim)结构域和一个退化的GGDEF结构域，C端为DHH-DHHA1催化结构域。OdpP能降解c-di-AMP和c-di-GMP生成pApA和pGpG，但是GdpP降解c-di-GMP的速率非常低。我们对GdpP全长，以及C端DHH-DHHA1结构域分别进行了蛋白表达纯化及结晶，最终获得了分辨率为2.2(A)的C端DHH-DHHA1结构域(GdpP-C)蛋白晶体，通过X-射线衍射晶体学解析得到GdpP-C的蛋白结构。分析发现GdpP-C的结构与已知的DHH-DHHA1结构非常相似，都包含保守的DHH与DHHA1结构基序，两个结构域之间由一段柔性loop相连。DHH结构域包含一个由两个锰离子组成的酶活中心，同时与Rv2837c结构相比，参与双锰配位的氨基酸是高度保守的，表明GdpP-C具有相同的双锰降解机制。　　为了进一步阐明OdpP的催化水解机制，我们利用小分子浸泡晶体的实验方法得到了GdpP-C蛋白与小分子c-di-AMP、c-di-GMP以及5-pApA的三种复合物结构。复合物结构的分辨率分别为2.15(A)、2.2(A)和2.6(A)。通过对GdpP-C以及三种复合物结构的比较分析，可以得出三种小分子以相同的伸展方向结合在GdpP-C的DHHA1结构域的相同位置，表明DHHA1结构域为底物识别结构域，但小分子的磷酸二酯键都远离位于DHH结构域的双锰活性中心，只有当中间的柔性loop区发生构象变化使DHH与DHHA1足够靠近时才可能发生降解反应。我们以之前实验室解析的活性状态的Rv2837c结构为模型模拟了活性状态下的GdpP-C的结构，在活性状态下三种小分子与DHHA1的结合没有发生变化，并且通过突变体酶活实验进一步证明了活性结构的可靠性。复合物结构充分展示了GdpP-C在降解底物过程中的底物结合以及产物生成的方式。结构分析显示GdpP-C结合底物的方式与Rv2837c有很大不同，鉴于之前我们实验室只拿到了Rv2837c降解c-di-AMP第二步反应的底物结合方式，因此我们大胆猜测GdpP-C的底物结合方式同样代表了Rv2837c第一步降解过程的底物结合方式。我们将DHH-DHHA1蛋白的底物结合位点分为三个亚位点并分别命名为R，C和G。GdpP-C在其C和G位点上水解c-di-AMP生成pApA，而在Rv2837c中pApA可以继续翻转到C和R位点并进一步降解为AMP。通过突变体酶活实验证明，扩大GdpP-C的C位点和R位点可以使GdpP-C具有进一步降解pApA的能力，同时突变Rv2837c的G位点和R位点的关键氨基酸可以分别阻碍c-di-AMP第一步与第二步的降解反应。此外我们还发现C位点决定了DHH-DHHA1特异性识别底物核苷酸的能力。结构分析及酶活验证揭示了DHH-DHHA1蛋白家族具有统一的催化机制。