血吸虫抗药性是血防工作关注的焦点之一,已有曼氏血吸虫产生吡喹酮(PZQ)抗性的报道。迄今,吡喹酮仍是治疗日本血吸虫病的唯一特效药,显然亦存在产生抗性的潜在危险。因此,研究能替代吡喹酮的抗血吸虫新药十分必要。然而,吡喹酮应用于治疗血吸虫病已有30多年,但其药物靶点及作用机制仍未阐明。课题组前期研究已建立了应用PZQ亚治疗剂量对小鼠体内日本血吸虫成虫进行抗性诱导的方法,并成功诱导出PZQ耐受日本血吸虫虫体。本研究拟在前期工作基础上诱导并收集PZQ耐受虫体并应用蛋白质组学方法对其进行差异表达蛋白检测分析,为深入阐明PZQ抗日本血吸虫机制及明确潜在靶点提供科学依据亦为研制抗血吸虫新药提供新的策略。第一部分 日本血吸虫PZQ耐受虫体的诱导目的:诱导日本血吸虫PZQ耐受虫体,为研究分析PZQ耐受虫体和未诱导虫体的差异表达蛋白奠定基础。方法:采用课题组前期研究的日本血吸虫PZQ耐受虫体诱导方法进行诱导,日本血吸虫单雄尾蚴(60～80(?))感染小鼠,感染3 w后,用PZQ亚治疗剂量(ED50,25.98 mg/kg)连续灌胃给药30 d,停药3 w,再用PZQ治疗剂量(200 mg/kg)连续灌胃给药5 d,停药2 w后,颈椎脱臼法处死并解剖小鼠,采用肝门静脉灌注法冲虫,挑选100%活力状态的虫体置于提前预热的DMEM低糖培养液中培养,加入不同浓度的PZQ,16 h后用生理盐水洗涤虫体三次后换上新的培养液,继续培养72 h,每24 h在体视显微镜下观察记录虫体活力分值,评价PZQ耐受虫体对药物的敏感性。结果:PZQ体外抗未诱导日本血吸虫成虫的临界致死浓度(虫体经药物作用后72 h后活力降低率达到90%的最低浓度)为1000 μmol/L,该浓度作用于PZQ耐受虫体72 h后活力降低率为66.7%,与未诱导虫体的活力降低率(92.2%)相比具有明显差异(P<0.0001),PZQ体外抗日本血吸虫PZQ耐受虫体的临界致死浓度为抗日本血吸虫成虫的4倍(4000 μmol/L)。结论:经PZQ诱导的日本血吸虫对PZQ的敏感性显著下降3倍,表现出明显的耐受性,表明PZQ耐受虫体诱导成功可用于后续实验研究。第二部分 WESTERN BLOTTING识别日本血吸虫PZQ耐受虫体功能性蛋白及质谱分析鉴定目的:应用日本血吸虫感染兔血清经蛋白质免疫印迹法(Western Blotting)对日本血吸虫PZQ耐受虫体与未诱导虫体差异表达蛋白进行免疫识别并分析鉴定,为阐明PZQ的作用机制及其潜在靶点提供新的实验依据。方法:应用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术(SDS-PAGE)分离两种虫体的总蛋白,应用Western Blotting识别出日本血吸虫PZQ耐受虫体与未诱导虫体的功能性蛋白差异表达位点,并切取凝胶中可被感染兔血清识别出的功能性差异蛋白表达位点的条带,应用液相色谱-质谱联用(LC-MS)技术筛选鉴定出PZQ耐受虫体与未诱导虫体差异表达蛋白分子,在线Uniprot检索差异蛋白分子的功能特性。结果:Western Blotting识别出日本血吸虫PZQ耐受虫体中有3个差异表达的功能性蛋白位点,灰度分析结果显示其中有2个上调位点分别为a(2.5±0.06 vs 1.00±0.00,P<0.0001)和 b(1.60±0.03 vs 1.00±0.00,P<0.0001),有 1 个下调位点为c(0.70±0.00 vs 1.00±0.00,P<0.0001)。应用LC-MS质谱技术筛选及鉴定PZQ耐受虫体功能性蛋白位点,结果表明,其中有5个蛋白分子差异表达,PZQ耐药性虫体差异表达的蛋白分子主要为1个膜相关蛋白和3个钙离子(Ca2+)结合相关蛋白(钙蛋白酶B、钙蛋白酶和亮氨酸拉链包含EF手型的跨膜蛋白1)。结论:PZQ持续压力下能够促进或抑制某些日本血吸虫特定蛋白质分子的表达,并发现本研究中的钙蛋白酶B、钙蛋白酶和亮氨酸拉链包含EF手型的跨膜蛋白1均是Ca2+结合相关蛋白,参与细胞信号传导过程,提示PZQ的抗虫靶点可能与钙离子结合相关蛋白有关。第三部分 日本血吸虫PZQ耐受虫体TMT差异性蛋白分析及鉴定目的:日本血吸虫PZQ耐受虫体与未诱导虫体两者的差异性表达蛋白分析及鉴定,同时与第二部分结果相比较筛选出功能相似或类似蛋白分子,应用TMT蛋白组学技术进一步阐明PZQ的作用机制及其潜在靶点。方法:应用定量蛋白质组学串联质量标签(TMT)标记技术对日本血吸虫PZQ耐受虫体与未诱导虫体总蛋白进行检测,并进行蛋白质定量分析,筛选PZQ耐受虫体中发生显著变化的差异蛋白(差异倍数超过1.3倍作为显著上调,差异倍数小于1/1.3作为显著下调),并将筛选到的差异蛋白进行生物信息学分析。结果:应用TMT标记定量蛋白组学组学分析得出总共有31个蛋白分子在日本血吸虫PZQ耐受虫体中差异表达,其中6个蛋白分子表达上调,25个蛋白分子表达下调,其中四跨膜蛋白表达差异倍数(ratio)为2.031,差异最显著。差异表达蛋白富集的生物通路主要为核糖体和溶酶体,核糖体途径中有2个核糖体蛋白分子表达上调和9个核糖体蛋白分子表达下调,溶酶体途径中有3个蛋白分子(四跨膜蛋白、V型质子ATP酶蛋白脂质亚单位、参与神经醇磷脂过程SJCHGC01869蛋白)表达上调和4个蛋白分子(羧肽酶、具有半胱氨酸型肽酶活性的假想蛋白、具有脱氧核糖核酸酶Ⅱ活性的未知蛋白和参与蛋白质去甲酰化过程的SJCHGC04223蛋白)表达下调。结论:本研究应用TMT蛋白组学技术检测(定量检测)结果显示PZQ耐受虫体中的四跨膜蛋白差异表达下调最为显著,而LC-MS技术(定性检测)则发现呈差异表达的有1个膜相关蛋白(FAM62B蛋白),1个跨膜蛋白(亮氨酸拉链包含EF手型的跨膜蛋白1),两种检测技术结果均提示PZQ抗日本血吸虫的潜在作用靶蛋白可与日本血吸虫膜相关蛋白/跨膜蛋白及Ca2+结合相关蛋白分子(钙蛋白酶B、钙蛋白酶)密切相关,其确切靶点蛋白分子有待进一步生物学研究。此外,这两种不同的方法均检测到与血吸虫体生命进程中蛋白质的翻译过程相关的差异表达蛋白分子如TMT检测到的核糖体蛋白与LC-MS技术检测到的翻译起始因子IF-2非分类亚单位蛋白,结果提示在PZQ持续压力下可能影响蛋白质的翻译过程进而导致虫体死亡,这也可能是PZQ的抗虫作用机制之一。