腹腔感染是腹部创伤、腹部外科疾病与腹部手术后的常见并发症,其发病率逐年增高。腹腔脏器损伤后各种复杂的手术方式使得其伴随的腹腔感染更为严重。人口的老龄化、以高血压糖尿病为代表的代谢疾病的高发使得腹腔感染的围手术期处理更具挑战性。腹腔感染患者病程中多合并血小板减少症。对临床医师而言,血小板减少不仅仅是十分普遍的现象,更为重要的是,血小板的减少与患者的临床预后直接相关。近年来,随着研究的深入,在感染-免疫反应中,血小板参与的免疫调节作用逐渐明确,这也使得系统性阐述腹腔感染这类外科重症患者病程中血小板计数的变化规律、探讨相应干预手段迫在眉睫。本课题首先通过回顾性临床研究,以我科收治的肠瘘合并腹腔感染患者为研究对象,评估肠瘘合并腹腔感染患者血小板减少的临床特征,明确肠瘘合并腹腔感染患者血小板减少的发生率,与患者临床预后之间的相关性及院内获得性血小板减少患者发生血小板减少的危险因素；接下来,我们通过流式细胞学技术,明确肠瘘合并腹腔感染患者中院内获得性血小板减少患者血小板前体比例变化的情况,探讨腹腔感染患者血小板减少可能的原因,分析肠瘘合并腹腔感染患者血小板减少时血小板凋亡现象在其中起到的作用,并对血小板前体预测腹腔感染患者临床预后的可能性做进一步探讨。动物实验部分,我们对小鼠尾静脉注射CD42单克隆抗体构建小鼠单纯血小板减少模型的可能性进行了分析,探索了小鼠尾静脉注射CD42单克隆抗体及腹腔注射LPS构建小鼠血小板减少合并腹腔感染脓毒症模型的可能性,初步明确血小板在腹腔感染脓毒症中是否参与了脓毒症相关免疫过程。此外,我们还设计了一个前瞻性、开放标签、多中心临床试验,评估重组人促血小板生成素用于严重腹腔感染合并脓毒症致血小板减少患者的安全性和有效性。这一系列研究从临床现象出发,在现象-机制-干预三个层面进行探讨,最终回归临床指导临床实践,加深了对于腹腔感染时血小板作用的认识。全文共分为四个部分：第一部分肠瘘合并腹腔感染患者血小板减少的临床特征调查研究目的：腹腔感染是肠瘘的常见并发症,肠瘘合并腹腔感染患者病程中多发生血小板减少症。目前,腹腔感染患者血小板减少的发生率、血小板减少与其他常见临床指标的相关性以及血小板减少发生的临床危险因素尚不明确。本部分研究将明确肠瘘合并腹腔感染患者血小板减少的发生率,分析血小板减少事件发生与否对于患者临床预后之间的相关性；探讨院内获得性血小板减少患者发生血小板减少的危险因素。研究方法：本部分研究为回顾性研究,通过检索南京军区南京总医院普通外科肠瘘治疗中心(8病区)于2013年1月1日至2014年12月31日两年时间内出院的肠瘘合并腹腔感染患者病历资料进行统计汇总分析。对于所有纳入研究的患者,记录患者入院时的年龄等人口学资料,记录患者入院时的APACHE II评分等疾病严重程度评分,白细胞计数等血常规数据,降钙素原等血生化数据。对于研究中基线水平不平衡的两组患者比较,引入倾向性匹配分析的方法进行比较。结果：本部分研究共收集1324人次肠瘘患者的病历资料,经过排除后,267份肠瘘合并腹腔感染患者病历资料纳入最终分析。本研究队列中,24名患者入院时合并血小板减少,占8.99%,入院时血小板是否正常与患者的最终预后相关,入院时是否合并血小板减少是患者预后的独立危险因素。入院时血小板正常的患者中院内血小板减少的发生率为13.99%(34/243),入院时ISTH评分高低是院内获得性的血小板减少的危险因素。院内血小板减少患者血小板减少事件发生与感染指标变化有相关性,与凝血指标相关性无统计学意义。结论：肠瘘合并腹腔感染患者血小板减少具有较高的发生率。无论是入院时合并的血小板减少还是住院期间新发的血小板减少都会影响患者的临床预后。对于肠瘘合并腹腔感染患者而言,感染的加重可能是血小板减少的使动因素。临床中对于肠瘘腹腔感染患者合并的血小板减少应引起足够的重视。第二部分肠瘘合并腹腔感染患者血小板减少的原因探索及临床应用研究目的：肠瘘合并腹腔感染患者血小板减少的发生率较高,但这部分患者血小板减少的原因是血小板生成的障碍还是血小板破坏的增加目前尚不明确。网织血小板能反映骨髓血小板的生成状态,为阐明肠瘘合并腹腔感染患者血小板减少病理生理过程提供了可能性。本部分研究将明确肠瘘合并腹腔感染患者中院内获得性血小板减少患者网织血小板变化的情况,探讨分析腹腔感染患者血小板减少可能的原因；探索肠瘘合并腹腔感染患者血小板减少时血小板凋亡现象在其中起到的作用及网织血小板比例预测腹腔感染患者临床预后的可能性。研究方法：本部分研究为前瞻性观察性临床试验,选取2013年6月至2014年6月南京军区南京总医院普通外科收治的肠瘘合并腹腔感染患者纳入研究。所有满足入组标准的患者在入院后留取外周静脉血标本2ml检测网织血小板比例、血小板磷脂酰丝氨酸暴露及血小板线粒体膜电位。结果：本部分研究共纳入肠瘘合并腹腔感染患者130例,所有患者网织血小板比例均值为2.40%。网织血小板比例与血小板计数之间存在良好的相关性。血小板正常患者和血小板减少患者相比,血小板减少患者的网织血小板比例明显增加,血小板减少的肠瘘合并腹腔感染患者血小板线粒体膜电位表现去明显的去极化,外翻程度增强。网织血小板比例与PCT等感染指标、INR等凝血指标之间存在相关性,预测患者预后的曲线下面积为0.537。结论：肠瘘合并腹腔感染患者血小板减少的原因在于血小板破坏的增加。血小板的凋亡过程参与到了肠瘘合并腹腔感染患者血小板破坏的过程中。网织血小板比例对于肠瘘合并腹腔感染患者的临床预后有着一定的预测价值。第三部分腹腔感染致脓毒症合并血小板减少动物模型的建立及初步探索研究目的：传统理论认为,血小板的主要生理功能为参与凝血及血栓形成过程。近年来,血小板介导的免疫过程逐渐被阐明。传统的小鼠脓毒症模型,血小板是否参与免疫过程无法明确,单纯血小板减少小鼠模型建立方法尚未统一。本部分研究计划探索小鼠尾静脉注射CD42单克隆抗体构建小鼠单纯血小板减少模型的可能性；探索小鼠尾静脉注射CD42单克隆抗体及腹腔注射LPS构建小鼠血小板减少合并腹腔感染脓毒症模型的可能性；初步明确血小板在腹腔感染脓毒症中是否参与了脓毒症相关免疫过程。研究方法：本部分实验为动物实验,选择C57/B6小鼠尾静脉注射CD42单克隆抗体0.4μg/g、2μg/g两个剂量,于注射后Oh、2h、4h、6h、8h三个组5个时间点检测检测小鼠外周血中血小板计数及其他血细胞的计数,评估CD42单克隆抗体尾静脉注射以后对小鼠血常规的影响。采用LPS 0.5mg/Kg、5mg/Kg和10mg/Kg三个剂量刺激小鼠,探讨构建腹腔感染合并脓毒症模型合适的LPS剂量。将前述的小鼠单纯血小板模型和腹腔感染合并脓毒症模型相结合,探讨血小板减少的情况下,小鼠发生腹腔感染合并脓毒症时的病理生理改变。结果：小鼠尾静脉注射CD42单克隆抗体后,其外周血中血小板计数迅速下降,尾静脉注射CD42单克隆抗体2h后,无论采用0.4gg/g低剂量还是2μg/g高剂量,小鼠外周血中血小板计数均可下降约80%,此后无论是0.4μg/g低剂量组还是2μg/g高剂量组,下降的血小板计数至第8小时仍然保持在较低水平,与对照组相比差异有统计学意义。与血小板计数迅速下降不同的是,小鼠外周血中其他细胞的计数保持相对稳定,无明显的增加或减少。同对照组小鼠相比,尾静脉注射0.4μg/g CD42单克隆抗体的小鼠在不同时间点组织器官的形态学方面无显著差异。腹腔注射LPS后至第72h时,中剂量组和高剂量组的小鼠死亡率分别在10%和40%,小鼠腹腔注射LPS 10mg/Kg后的小鼠在形态学方面呈现出明显的脓毒症改变。血小板减少合并腹腔感染脓毒症小鼠造模后,血小板的下降更加显著,至第48h小时仍无恢复,同对照组相比,肝脏的炎症反应变化明显,与血生化检测结果相吻合。在血小板减少时,相较于血小板正常的小鼠,在LPS刺激下机体炎症反应更加明显。结论：小鼠尾静脉注射0.4μg/g CD42单克隆抗体可以有效的诱导出小鼠单纯血小板减少模型,腹腔注射LPS10mg/Kg的剂量可以诱导出有一定的死亡率的小鼠腹腔感染合并脓毒症模型。在血小板减少的情况下,脓毒症小鼠死亡率明显增加,炎症反应剧烈程度增加,表明血小板直接参与了脓毒症炎症反应的病理生理过程。第四部分重组人促血小板生成素对于严重腹腔感染致脓毒症合并血小板减少患者安全性及疗效的多中心临床研究研究目的：肠瘘合并腹腔感染患者发生血小板减少以后,针对血小板减少的病因治疗是至关重要的。在针对病因治疗的同时,对症的治疗同样重要。目前临床上,血小板减少主要干预手段为输注血小板。但在临床实际操作过程发现,血小板输注后患者血小板增加的情况与输注的量之间并非是线性关系。血小板的生成过程存在很多的刺激因子进行调控,促血小板生成素就是其中最重要的一种。在本部分,我们设计了一个前瞻性、开放标签、多中心临床试验,旨在评估重组人促血小板生成素用于严重腹腔感染合并脓毒症致血小板减少患者的安全性和有效性。研究方法：本研究为前瞻性、开放标签、多中心临床试验,本研究获得南京军区南京总医院医学研究伦理委员会批准。选择符合入组标准的患者入组,排除满足排除标准的患者。主要终点指标为28天病死率。本研究在中国大陆8家医疗机构招募受试人群。结果：本研究从2014年4月启动进入试运行阶段,于2014年6月起进入正式研究阶段,至2015年11月停止招募患者,共计运行1年零5个月,招募患者164名,共计125名患者纳入了最终分析。两组患者入组时,在年龄、性别、基础疾病、手术史及病情严重程度评分方面无统计学差异,具有可比性。入组后两组患者血小板计数持续上升,两组患者相比较,至第12天时血小板计数无统计学差异,但重组人促血小板生成素组患者血小板输注的量明显少于对照组,差异有统计学意义。所有不良事件均判断与疾病有关,与试验药物无关。结论：对于脓毒症合并血小板减少的患者,应用重组人促血小板生成素,可以有效改善血小板减少的情况,减少患者血小板输注的量,且无重大安全性风险,但两组患者的临床预后无统计学差异。