橘小实蝇Bactrocera dorsalis(Hendel)是一种重要的农业害虫,主要以幼虫潜食为害。橘小实蝇的寄主十分广泛,可危害柑桔、瓜类等多种水果、蔬菜和花卉。肠道微生物与昆虫本身密切相关,影响着宿主很多生理功能,如营养代谢、免疫等方面。本研究采用RT-PCR和RACE技术克隆获得基因PGRP-LB和PGRP-SB的ORF框序列,并通过注射和喂食大肠杆菌Escherichia coli研究橘小实蝇上述基因对条件致病菌的免疫响应;通过RNA干扰技术沉默基因PGRP-LB和PGRP-SB,分析橘小实蝇的免疫响应及肠道微生物群落的变化,阐述这些基因在橘小实蝇免疫和肠道微生物稳态维持中的作用,以期为橘小实蝇的综合防治提供一种全新的防控思路和作用靶标。1 PGRP-LB和PGRP-SB基因的克隆与表达模式从NCBI获得橘小实蝇PGRP-LB基因ORF框的核苷酸序列长度为738bp,成功克隆到橘小实蝇PGRP-SB基因ORF框的核苷酸序列,其长度为558bp。序列分析表明两个基因均与地中海实蝇相应基因序列的同源性最高,分别为86%和91%。表达模式结果表明PGRP-LB基因在橘小实蝇成虫中肠中表达量最高,其次在成虫脂肪体中表达量也较高,PGRP-SB基因主要在三龄幼虫和性成熟成虫脂肪体中表达。2 PGRP-LB和PGRP-SB基因对条件致病菌感染的免疫响应通过对橘小实蝇注射或喂食感染条件致病菌E.coli后,Imd信号通路中的抗菌肽基因Diptericin的表达量显著增加,注射E.coli后6h反应最强烈,Diptericin的表达量上调了6.40倍,喂食E.coli后12h反应最强烈,Diptericin的表达量上调了4.52倍;同时PGRP-LB和PGRP-SB基因表达水平明显上调,注射菌液后6h PGRP-LB基因表达量上调2.97倍,注射菌液后24h PGRP-SB基因表达量上调1.61倍;喂食菌液后12h PGRP-LB和PGRP-SB基因反应均最强烈,表达量分别比对照组上调了54.32%和30.26%。但注射感染比喂食感染引起的体液免疫反应更为强烈迅速。这些结果表明E.coli能启动橘小实蝇系统及肠道Imd信号通路的免疫反应,且抗菌肽基因Diptericin与PGRP-LB和PGRP-SB基因在免疫防御过程中起着重要作用。3 PGRP-LB和PGRP-SB基因对橘小实蝇免疫反应的影响通过干扰PGRP-LB和PGRP-SB基因后注射或喂食E.coli研究PGRP-LB和PGRP-SB基因在橘小实蝇免疫中的作用。研究发现,沉默PGRP-LB和PGRP-SB基因的橘小实蝇在注射或喂食感染E.coli后,其抗菌肽基因Diptericin的表达量与对照组相比均显著上调,免疫反应增强且免疫反应持续时间增长。以上结果说明PGRP-LB和PGRP-SB基因能抑制橘小实蝇肠道免疫系统过激的免疫反应,起到免疫负调控作用。4 PGRP-LB和PGRP-SB基因沉默对橘小实蝇肠道微生物群落的影响通过PGRP-LB和PGRP-SB基因的RNAi,研究PGRP-LB和PGRP-SB基因在橘小实蝇肠道内共生菌群落稳态维持中的作用。Real-time PCR结果表明,干扰后5天内PGRP-LB和PGRP-SB基因表达量都处于下调状态,第15天时基因表达量恢复正常,与对照组表达量无显著差异。同时分别于第5、15、20天检测肠道微生物群落变化,结果表明PGRP-LB基因干扰后第5天肠道内总细菌数量、γ-变形菌门(γ-Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)细菌分别下调18.78%、56.67%、61.98%和67.46%;PGRP-SB基因干扰后第5天肠道内总细菌数量、α-变形菌门(α-Proteobacteria)、γ-变形菌门(γ-Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)分别下调31.73%、40.41%、44.64%、50.26%、52.19%和70.18%。PGRP-LB基因干扰后第15天肠道内总细菌数量、α-变形菌门(α-Proteobacteria)、γ-变形菌门(γ-Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)细菌分别上调2.16倍、1.04倍、1.65倍、0.38倍、2.70倍、0.84倍。PGRP-SB基因干扰后第15天肠道内总细菌数量和放线菌门(Actinobacteria)细菌无显著变化,α-变形菌门(α-Proteobacteria)、γ-变形菌门(γ-Proteobacteria)细菌分别上调53.77%和60.48%,拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)细菌分别下调14.89%和63.60%。PGRP-LB基因干扰后第20天肠道内总的细菌和五个门的细菌数量均恢复到正常水平。PGRP-SB基因干扰后第20天肠道内总的细菌和γ-变形菌门(γ-Proteobacteria)细菌分别下调45.96%和62.06%,其他四个门的细菌数量没有显著变化。这些结果表明PGRP-LB和PGRP-SB基因的缺失确实能够引起橘小实蝇肠道微生物群落的改变,PGRP-LB和PGRP-SB基因在肠道微生物群落稳态维持中起着不可或缺的作用。