阳虚证是常见的和重要的中医证侯之一,涉及到临床上各种各样的疾病,是临床治疗的重点。因此探索阳虚证的形成机制和改变因素,阳虚证时常见实验室检测指标的改变,比较不同阳虚动物模型的异同与特点,并进行总结与分析,以便进一步发展和应用阳虚证动物模型,给临床辨证论治提供科学依据,这就成为中医基础研究的热点之一。这既是中医现代化的需要,也是中医药发展的必然趋势。近年来中药相反理论成为现代药性理论争议最多的问题之一,争论的核心主要集中在其配伍禁忌的合理性,而在反药配伍以附子和半夏的配伍应用为最多最广。现代实验研究表明,两者“相反”理论存在一定的依据,但关于两者配伍的各实验结果之间均有不一致的现象,暂未能形成相统一的结论。如两者配伍后毒性有与单用相近、减弱或是加强的截然不同的结果。因此,开展具有中医药理论特色的相关药物研究,探讨探索动物实验中相反药对在方剂中作用的规律性与合理性,如两者的配伍剂量、比例等,全面系统的研究相反药对,搞清配伍禁忌未被认知的条件,科学阐释其机制和内涵,为指导临床合理的运用相反药对提供依据。并为临床上更安全、高效和广泛的应用有毒中药开辟新途径。研究目的1.附子半夏不同配伍比例的小鼠急性毒性研究,计算出小鼠半数致死率(LD50),比较二者不同配伍对小鼠一般行为学和各脏器指数的影响,为临床用药安全性提供参考。2.观察附子半夏不同比例配伍对阳虚大鼠模型的药效学影响,具体包括对大鼠环核苷酸系统、下丘脑—垂体—靶向(甲状腺、肾上腺、性腺)轴、大鼠肠胃功能、对大鼠心脏、肝脏、肾脏、脾脏、小肠组织Na+_K--ATP酶活性的影响、各脏器MCT8表达量的影响、对大鼠不同脏器影响的病理变化。研究方法1.附子半夏不同配伍比例的小鼠急性毒性研究:本实验与临床用药一致,采用与经口给药途径,通过预实验得到小鼠0%(全没死)及100%(全死)的大致剂量范围,选择附子与半夏不同比例配伍的三种水煎液进行实验。100只小鼠适应性饲养1周后,小鼠禁食不禁水16h,称重后按体重进行随机分组。将小鼠分为雌雄各半的10组,即附子:半夏=1:2的低、中、高剂量组,附子:半夏=1:1的低、中、高剂量组、附子:半夏=2:1的低、中、高剂量组和对照组,每组各10只。首先从中剂量开始,陆续灌胃给予小鼠一次不同剂量的药液,灌胃结束后密切观察小鼠的毒性反应情况,连续观察14天,中间记录灌服后小鼠自主活动及行为变化,每种急毒体征发生的时间、持续时间、体征表现程度和各种体征发展或转归的过程。并记录小鼠的死亡情况,死亡前特征,死亡时间及小鼠质量,心、肝、脾、肺、肾、脑各脏器质量,计算各脏器指数,并对死亡动物进行大体解剖观察,记录所观察到的变化,及死亡小鼠各脏器进行病理学检测。根据死亡情况用统计学软件计算出各组的LD50.用SPSS20.0软件进行进行处理和统计分析,机率单位加权回归法(Bliss法)计算LD50及LD5o的95%可信区间。2.附子半夏配伍对阳虚模型大鼠的药效学研究:取40只大鼠适应性饲养1周后均无异常后纳入实验。随机分为5组,每组8只,称重标记。其中4组于每日上午肌注氢化可的松注射液及灌胃大黄水煎液。连续17天。第5组作为健康对照组。第18天起,在维持原造模方案不变的基础上,于每日上午给予3组造模组分别灌胃分别灌胃不同比例附子半夏配伍的水煎剂,日一次,连续2周。余1组造模组作为模型对照组。末次给药后禁食不禁水一晚,第二天以10%的水合氯醛(0.35ml/100g体重)腹腔麻醉后进行腹主动脉采血,取大鼠心、肝、脾、肾、小肠组织,-80℃下保存备用。ELISA试剂盒法检测大鼠的血清环核苷酸水平(cAMP/cGMP)含量、测定附子半夏配伍对阳虚模型大鼠神经内分泌系统的影响,即T3、T4、TSH、促肾上腺皮质激素(ACTH)、皮质醇(CORT)、促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、睾酮(T)、以及胃肠功能包括胃泌素和胃动素水平,超微量总ATP酶试剂盒测定大鼠各个不同组织的总ATP酶活力水平,HE染色做病理切片对阳虚和正常大鼠的心、肝、肾、脾、胸腺等组织进行病理学研究。3.PCR法测定各组织MCT8表达量。结果1.实验计算所得附子:半夏=1:2组、附子:半夏=1:1组、附子:半夏=2:1组的LD50分别为0.975、1.207和1.669。与对照组相比,各给药组小鼠的心脏指数上升,有显著性差异(P<0.05);肝脏指数上升,有显著性差异(P<0.05);脾脏指数增加,有显著性差异(P<0.05);肺脏指数变化中,附子:半夏=1:2中剂量组、附子:半夏=1:2高剂量组有显著性差异(P<0.05),其余组别未见明显变化;肾脏指数增加,有显著性差异(P<0.05);脑指数增加,有显著性差异(P<0.05)。2.大鼠环核苷酸水平变化:与健康对照组相比,模型组血清cAMP含量下降(P<0.05),血清cGMP含量上升,有显著性差异(P<0.05),血清cAMP/cGMP比值降低,有极显著性差异(P<0.05);与模型组比较,给予治疗药后血清cAMP含量上升,有显著性差异(P<0.05);血清cGMP含量上升,有显著性差异(P<0.05);血清cAMP/cGMP比值上升,有极显著性差异(P<0.05);下丘脑—垂体—甲状腺轴的激素水平变化:与健康对照组相比,模型组血清T3、T4、TSH含量下降,有显著性差异(P<0.05);与模型组比较,给予治疗药后血清T3、T4、TSH含量均出现升高,有显著性差异(P<0.05);下丘脑—垂体—肾上腺轴的激素水平变化:与健康对照组相比,模型组血清CORT、CRH含量下降,有显著性差异(P<0.05);与模型组比较,给予治疗药后附子:半夏=1:1与附子:半夏=2:1组血清CORT含量出现升高,有显著性差异(P<0.05),附子:半夏=1:2组未见明显差异,三个给药组血清CRH含量均有显著性上升(P<0.05);下丘脑—垂体—性腺轴的激素水平变化:与健康对照组相比,模型组血清睾酮(T)水平出现下降,有显著性差异(P<0.05);与模型组比较,给予治疗药后附子:半夏=1:1与附子:半夏=2:1组血清T含量出现升高,有显著性差异(P<0.05),附子:半夏=1:2组未见明显差异。各给药组之间差异不明显。肠胃功能激素水平的变化:与健康对照组相比,模型组血清胃泌素、胃动素水平出现下降,有显著性差异(P<0.05);与模型组比较,给予治疗药后附子:半夏=1:1与附子:半夏=2:1组血清胃泌素含量出现升高,有显著性差异(P<0.05),附子:半夏=1:2组未见明显差异,三个给药组血清胃动素含量均有显著性上升(P<0.05);各给药组之间差异不明显。对大鼠心脏、肝脏、肾脏、脾脏、小肠组织Na+_K--ATP酶活性的影响:与健康对照组相比,模型组心脏、肾脏、脾脏、小肠Na+_K--ATP酶活性均出现下降,有显著性差异(P<0.05),肝脏Na+_K--ATP酶活性未见显著变化;与模型组比较,给予治疗药后血大鼠心脏、肝脏、肾脏、脾脏、小肠Na+_K--ATP酶活性均出现升高,有显著性差异(P<0.05);三个给药组之间的比较,附子:半夏=1:1组与附子:半夏=1:2组相比,大鼠心脏、脾脏、肾脏、小肠Na+_K--ATP酶活性均出现升高,均有显著性差异(P<0.05),肝脏Na+_K--ATP酶活性变化未见显著差异;而附子:半夏=2:1组与附子:半夏=1:1组相比,大鼠心脏Na+_K--ATP酶活性均出现升高,存在显著性差异(P<0.05),而肝脏、肾脏、脾脏、小肠组织Na+_K--ATP酶活性未见显著差异。对大鼠心、脾、肾脏中MCT8表达量的影响:与健康对照组相比,模型组心脏、脾脏、肾脏组织MCT8表达量下降,有显著性差异(P<0.05);与模型组比较,给予治疗药后心脏、脾脏、肾脏组织MCT8表达量均出现升高,有显著性差异(P<0.05);三个给药组之间的比较,附子:半夏=1:1组与附子:半夏=1:2组相比,心脏、脾脏、肾脏组织MCT8表达量未见显著性差异,,而附子:半夏=2:1组与附子:半夏=1:1组相比,脾脏组织MCT8表达量上升,存在显著性差异(P<0.05),而心脏和肾脏组织MCT8表达量变化不明显,附子:半夏=2:1组与附子:半夏=1:2组相比,心脏、脾脏、肾脏组织MCT8表达量变化均有显著性差异(P<0.05)。3.结论1.关于小鼠半数致死量。本实验发现,随着配伍中附子比例的下降或半夏比例的上升,小鼠的半数致死量逐渐升高,说明该配伍中起毒性作用的药物主要是半夏而非附子,另外实验小鼠的LD50换算为成人剂量时远大于药物的临床一般服用剂量,这在一定程度上说明临床用药是相对安全的。另外,本实验结果中染毒小鼠的心、肝、脾、肾、脑多个组织的脏器指数均出现异常,体征变化也涉及到机体不同系统的功能异常,表明附子半夏配伍对机体的影响是多器官、多系统、多方面的。2.附子半夏配伍能显著改善阳虚模型大鼠的血清cAMP/cGMP水平、提高下丘脑—垂体—靶向(甲状腺、肾上腺、性腺)轴的相关激素水平,改善阳虚大鼠的肠胃功能、并使大鼠心脏、肝脏、肾脏、脾脏、小肠组织的Na+_K--ATP酶活性增加,提高能量代谢水平。即这些评价阳虚水平的一系列指标变化主要是受附子所占比例的影响,即附子量相对越大,对激素水平的影响越大。本实验中测定了心脏、脾脏、肾脏中的MCT8表达量,发现阳虚大鼠的各组织MCT8表达量均出现不同程度的变化,与能量代谢的变化水平相一致。其中,对心脏和脾脏的作用最为明显。从补阳的机理而言,说明在附子和半夏的配伍中,对阳虚起主要治疗作用的是附子,而古人之所以附子半夏配伍使用,乃是因为阳虚多夹湿夹痰。因阳虚则脾阳亦虚,“脾气散精,上归于肺”的功能无法执行,水饮内停,为湿为痰饮。本实验同时也表明,附子半夏的配伍对增效减毒方面的影响意义不大。阳虚模型大鼠的各脏器组织病理学除肝脏、胸腺、肾脏有部分改变外,其余脏器几乎无改变或改变差异性不显著。