太平洋牡蛎多糖的提取、分离、结构及硫酸酯化修饰研究

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牡蛎(Concha Ostreae)资源丰富,肉味鲜美,营养价值较高,素有“海底牛奶”的美称。牡蛎肉中含有丰富的多糖,具有良好的免疫调节、抗氧化、抗病毒和降血糖活性。本实验以来源于青岛海域的新鲜太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)为原料,采用不同的提取和层析分离方法得到了5种多糖组分,并对其中的1种水溶性多糖纯化组分CT-11的结构进行了较为系统的研究。通过对CT-11硫酸酯化修饰,制备得到了1种牡蛎多糖硫酸酯,并对其体外抗凝和抗肿瘤活性进行了初步的评价。本文依次采用常温水、60℃热水、稀碱溶液对牡蛎多糖进行了提取,采用胃蛋白酶和胰蛋白酶双酶法对粗多糖进行去蛋白,分别得到了常温提牡蛎粗多糖(CT)、热水提牡蛎粗多糖(RT)和碱提牡蛎粗多糖(JT)3种粗多糖,得率分别为16.1%、1.9%和13.3%。采用硫酸-苯酚法和Folin-酚法分别测得CT的总糖含量为87.4%,蛋白含量10.4%;RT的总糖含量67.9%,蛋白含量21.8%;JT的总糖含量为42.9%,蛋白含量47.7%。采用PMP柱前衍生高效液相色谱法测得3种粗多糖均为葡聚糖,高效凝胶渗透色谱法联合多角度激光散射仪测定其分子量分别为2.1×106Da,2.0×106Da和9.8×105Da。本文对3种粗多糖CT、RT和JT,分别采用DEAE Sepharose FF阴离子交换层析和Sepharcryl S-400凝胶层析进行了分离和纯化,获得了CT-11、CT-21、RT-11、RT-21和JT-11等5个纯化多糖组分。对其中得率较高的CT-11进行了基本理化性质测定,结果表明其总糖含量为95.1%,蛋白含量为4.7%,相对分子质量为1299kDa,而且其高效液相色谱峰形对称,表明具有较高的纯度。采用红外光谱(IR)、电喷雾质谱(ESI-MS)、甲基化、气质联用(GC-MS)和核磁共振波谱(NMR)对CT-11的化学结构进行了分析,确定其结构是以→4)-α-D-Glc-(1→为主,含有→3,4)-β-D-Glc(1→和→2,4)-β-D-Glc(1→的吡喃葡聚糖。本文分别采用SO3-吡啶法和氯磺酸-甲酰胺法对CT-11进行了硫酸酯化修饰,获得了2种硫酸酯化多糖CT-S1和CT-S2,测得其硫酸根含量分别为36.2%和43.1%。对硫酸酯化程度较高的CT-S2进一步分析,测得其分子量为11.2kDa,硫酸根取代度为1.34。通过IR和NMR可确定CT-S2的硫酸酯反应主要发生在(1→4)-Glc的C-6位,在C2和C3位也存在硫酸基取代。本文对CT-S2的体外抗凝和抗肿瘤活性进行了初步评价,结果表明:CT-S2具有显著延长活化部分凝血酶时间(APTT)和凝血酶时间(TT)的作用,但对凝血酶原时间(PT)影响不大,表明其抗凝作用主要是通过内源性凝血系统途径实现; CT-S2对人结肠癌细胞HCT-116具有明显的抑制活性,对人早幼粒白血病细胞HL-60和人肺腺癌细胞A-549细胞也具有一定的抑制作用,并存在量效关系,但对人宫颈癌细胞hela和人肺腺癌细胞K562无抑制作用。目前对牡蛎多糖的研究主要集中在粗多糖的提取、基本理化性质和生物活性筛选研究方面,有关牡蛎多糖的分离纯化、结构分析和分子修饰方面的系统研究报道尚不多见。本文的相关研究结果为牡蛎多糖的结构与生物活性的深入研究和药用开发提供了基础,也为牡蛎资源的综合利用提供了参考。
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