论文部分内容阅读
喜马拉雅紫茉莉(Mirabilis himalaica),藏语名“巴朱”,为常用珍稀濒危藏药材,其根为药用部位。鱼藤酮是从喜马拉雅紫茉莉中分离的代表性天然产物,具有抗肿瘤等广泛生物活性。本文建立了喜马拉雅紫茉莉发根诱导培养体系,考察了多个因素对喜马拉雅紫茉莉发根诱导培养及鱼藤酮积累的影响；从喜马拉雅紫茉莉中克隆了鱼藤酮合成途径上的苯丙氨酸解氨酶(MhPAL). 查尔酮合成酶 (MhCHS)和查尔酮异构酶(MhCHI)三个基因,采用重组蛋白质或基于发根的转基因方法研究了它们的功能。用农杆菌C58C1(pRiA4)诱导喜马拉雅紫茉莉产生发根,对影响喜马拉雅紫茉莉诱导发根频率的不同因素进行了考察,结果发现不同因素对喜马拉雅紫茉莉发根诱导率影响较大：喜马拉雅紫茉莉幼嫩叶片发根诱导率最高,达到32%,叶片是诱导发根的理想外植体；喜马拉雅紫茉莉幼嫩叶片预培养2-3d,发根诱导率为26-32%,预培养2-3d有利于叶片诱导出发根；农杆菌浸染时间为20 min时,喜马拉雅紫茉莉幼嫩叶片发根诱导率最高,为34%。PCR鉴定结果表明,能够从Ri质粒和喜马拉雅紫茉莉发根基因组中扩增出423 bp的rolB和626 bp的ro1C基因片段,而从喜马拉雅紫茉莉根中未能扩增出上述基因片段,证明获得了喜马拉雅紫茉莉发根。进一步培养发现,在MS、1/2MS、B5、1、2B5这4种液体培养基中,1/285和1/2MS有利于喜马拉雅紫茉莉发根生物量积累；对鱼藤酮含量检测结果表明,1/2MS和MS液体培养基有利于鱼藤酮积累,B5和1/285不利于鱼藤酮积累,而用1/285液体培养基培养的喜马拉雅紫茉莉发根中没有检测到鱼藤酮。鱼藤酮生物合成起始于苯丙氨酸解氨酶、查尔酮合成酶和查尔酮异构酶催化的生物合成途径。本文从喜马拉雅紫茉莉中克隆了MhPAL、MhCHS和MhCHI并开展了相关研究。MhPAL的cDNA全长2299 bp,编码一个713个氨基酸残基的多肽。生物信息学分析表明MhPAL计算分子量为77.55 kDa,理论等电点为5.9,与其他植物PAL较为相似；多重比对表明MhPAL与石竹、辣椒和烟草等的PAL相似度高达80%以上；结构模拟显示MhPAL具有构成植物PAL催化活性中心的3个保守氨基酸残基位点：Y102-N254-Q342.MhCHS的cDNA全长1468 bp,编码一个392个氨基酸残基的多肽。生物信息学分析表明MhCHS计算分子量为43.2kDa,理论等电点为6.02,与其他植物CHS较为相似；多重比对表明MhCHS与石竹和首乌的CHS相似度高达80%以上；结构模拟显示MhCHS具有构成植物CHS催化活性中心的四个保守氨基酸残基位点：C165-F216-H304-N337。 MhCHI的cDNA 全长 819 bp, 编码一个221个氨基酸残基的多肽,该多肽的计算分子量为24.OkDa,理论等电点为5.18。MhCHI的分子量与已经报道的豆科植物的CHI蛋白质完全相同；多重比对和结构模拟结果显示MhCHI具有构成植物CHI催化活性中心的4个保守氨基酸残基T50-Y108-Q115-T192;分子系统树分析结果表明MhCHI与II型CHI更加接近。采用实时荧光定量PCR检测了MhPAL、MhCHS和MhCHI在喜马拉雅紫茉莉根、茎和叶中的相对表达量。结果表明MhPAL只在喜马拉雅紫茉莉根有表达；MhCHS在喜马拉雅紫茉莉的根、茎、叶中都有表达,但是在根中的表达量最高,在茎和叶中表达量较低,而茎和叶中MhCHS表达量没有显著性差异；MhCHI同样在喜马拉雅紫茉莉的根、茎、叶中都有表达,但是在根中的表达量最高,在叶中表达量最低；MhPAL、MhCHS和MhCHI的表达模式十分类似,这三者表达表现出的协同性有利于相关代谢产物的生物合成。同时平行测定了喜马拉雅紫茉莉的根、茎、叶中鱼藤酮含量,结果表明根中鱼藤酮含量最高。喜马拉雅紫茉莉鱼藤酮含量在根中最高的结果与MhPAL、MhCHS和MhCHI表达量的趋势基本吻合,表明根是喜马拉雅紫茉莉合成鱼藤酮的主要器官,这也为喜马拉雅紫茉莉根入药提供了科学依据。为进一步研究MhPAL、MhCHS和MhCHI在鱼藤酮生物合成中的作用,采用重组蛋白结合底物饲喂研究了MhPAL的功能,采用转基因技术研究了MhCHS和MhCHI的功能。采用大肠杆菌重组蛋白质结合底物饲喂鉴定了MhPAL的功能：MhPAL重组蛋白质分子量为77kDa,饲喂苯丙氨酸,TLC和LC-MS分析结果表明,MhPAL能够将苯丙氨酸转化为反式肉桂酸,进一步的酶动力学研究发现重组的纯化MhPAL的Km为0. 1001mM, Vmax为2.212mM/min。MhPAL蛋白质功能的鉴定为利用该基因遗传改造喜马拉雅紫茉莉鱼藤酮生物合成途径提供了一个功能明确的候选基因。采用转基因方法获得了过表达MhCHS或MhCHI的喜马拉雅紫茉莉发根。PCR检测结果表明,转MhCHS喜马拉雅紫茉莉发根中能同时检测到一个1405bp包括35S启动子和MhCHS的特异性片段,502bp的NPTII基因片段,423bp的rolB和626bp的ro1C基因片段；转MhCHI喜马拉雅紫茉莉发根能同时检测到一个782bp包括35S启动子和MhCHI的特异性片段,502bp的NPTII基因片段,423bp的ro1B和626bp的ro1C基因片段。实时荧光定量PCR检测结果表明,转MhCHS/MhCHI喜马拉雅紫茉莉发根中对应基因的表达量均高于非转基因发根对照。HPLC检测鱼藤酮含量结果表明,过表达MhCHS/MhCHI在多数发根中都能够提高鱼藤酮含量,表明过表达CHS/CHI均强化了鱼藤酮生物合成,为进一步采用突破生物合成途径限速反应的策略培育鱼藤酮高含量喜马拉雅紫茉莉植株奠定了基础。