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口蹄疫(Foot and Mouth Disease FMD)是由口蹄疫病毒(Foot and Mouth DiseaseVirus FMDV)引起的偶蹄动物急性、热性、高度接触性传染病,是危害畜牧业最严重的传染病之一,也是造成家畜及其产品国际贸易受阻的重要疾病,被国际兽医局(OIE)和联合国粮农组织(FAO)在国际动物卫生法典中列为18种A类传染病之一,近年又被列为重大跨国动物疫病的全球消灭计划及生物武器安全公约组织重点检查对象。中国政府公布的《动物病原微生物分类明录》将口蹄疫病毒列为十种一类动物病原微生物之一。FMDV属于小RNA病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒属(Aphthovirus),有七个血清型,分别为A、O、C、Asia1和南非SAT1、SAT2、SAT3,每种血清型里又可分为许多亚型,不同血清型之间没有交叉保护力,其中O型口蹄疫分布最广,在非洲、南亚、中东和南美许多国家广泛分布,在我国的口蹄疫病例大多都是O型口蹄疫。免疫预防接种是控制乃至消灭口蹄疫的主要措施,目前使用O型口蹄疫灭活疫苗预防该病,取得了一定的效果,但是仍需改进。本研究以伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)基因缺失株TK~-/gE~-/LacZ~+为载体,融合表达具有免疫增强作用的牛疱疹病毒Ⅰ型VP22基因和O型FMDV的主要抗原基因P1或P1/2A/3C,构建了基因工程二价疫苗株,达到一针预防两种疾病的目的。同时以pcDNA3.1(+)为载体构建了DNA疫苗pcDNA-VP22-P1和pcDNA-VP22-P1/2A/3C。用Balb/c小鼠模型比较了重组病毒TK/gE/VP22-P1、TK~-/gE~-/VP22-P1/2A/3C和DNA疫苗pcDNA-VP22-P1和pcDNA-VP22-P1/2A/3C及猪口蹄疫O型灭活疫苗的免疫效果。1.牛疱疹病毒Ⅰ型VP22基因、O型口蹄疫病毒P1和P1/2A/3C基因的克隆与序列分析为了将VP22基因分别与FMDV的P1基因和P1/2A/3C基因的5’端按照正确的阅读框架融合,首先设计一对分别含有HindⅢ和EcoRⅤ酶切位点的上、下游引物,从含有牛疱疹病毒Ⅰ型VP22基因的重组质粒中扩增出不含终止密码子的牛疱疹病毒Ⅰ型VP22基因编码区;再用分别含有EcoRV和XbaⅠ酶切位点的上、下游引物,从含有O型FMDV P1基因和P1/2A/3C基因的重组质粒中分别扩增出不含起始密码子的P1基因和P1/2A/3C基因;将扩增的VP22基因、P1基因和P1/2A/3C基因,分别克隆到pMD18-T载体,获得重组质粒pMD18-T-VP22、pMD18-T-P1和pMD18-T-P1/2A/3C。DNA测序结果表明,三个基因的序列与已经公布的序列完全一致。2.共表达牛疱疹病毒Ⅰ型VP22基因和O型口蹄疫病毒主要免疫原性基因的DNA疫苗的构建及其免疫原性的效果用HindⅢ和EcoRⅤ酶切pMD18-T-VP22后,凝胶回收VP22基因,并定向克碌秸婧吮泶镏柿cDNA3.1(+)的HindⅢ和EcoRⅤ酶切位点之间,获得重组质粒pcDNA-VP22;将pMD18-Y-P1和pMD18-T-P1/2A/3C分别用EcoRⅤ和XbaⅠ酶切后凝胶回收,回收片段分别定向克隆到pcDNA-VP22的EcoRⅤ和XbaⅠ酶切位点之间,使其与VP22的3’端融合,分别获得重组表达质粒pcDNA-VP22-P1和pcDNA-VP22-P1/2A/3C。然后用Balb/c小鼠模型评价了pcDNA-VP22-P1和pcDNA-VP22-P1/2A/3C两种DNA疫苗及本实验室以前构建的不含VP22的DNA疫苗pcDNA-P1和pcDNA-P1/2A/3C的免疫效果。结果显示,首免后14天和28天,四种DNA疫苗均产生了可以检测到的FMDV ELISA抗体和中和抗体;含VP22的DNA疫苗(pcDNA-VP22-P1、pcDNA-VP22-P1/2A/3C)的抗体水平在二免后显著高于不含VP22的DNA疫苗(pcDNA-P1、pcDNA-P1/2A/3C)(P＜0.05);DNA疫苗与FMDV灭活疫苗联合免疫的抗体水平显著高于DNA疫苗单独免疫(P＜0.05),但与FMDV灭活疫苗单独免疫没有显著差异(P＞0.05)。淋巴细胞增殖试验结果显示,DNA疫苗诱导细胞免疫的水平远远高于FMDV灭活疫苗(P＜0.05)。3.共表达牛疱疹病毒Ⅰ型VP22基因和O型口蹄疫病毒多抗原表位的重组伪狂犬病毒的构建及其免疫应答利用通用转移载体pIECMV,构建了转移载体pIECMV-VP22-P1和pIECMV-VP22-P1/2A/3C。以PRV TK~-/gE~-/LacZ~+为亲本株,分别构建了融合表达VP22-P1和VP22-P1/2A/3C的重组病毒TK~-/gE~-/VP22-P1和TK~-/gE~-/VP22-P1/2A/3C,经空斑纯化、PCR和Southern杂交鉴定,获得了纯化的病毒。Western blot证实VP22-P1和VP22-P1/2A/3C在重组伪狂犬病毒中得到表达。检测了重组病毒的遗传稳定性和增殖滴度。用该重组病毒免疫Balb/c小鼠,并与亲本株和O型口蹄疫灭活苗进行比较。结果显示,无论是TK~-/gE~-/VP22-P1疫苗免疫组,还是TK~-/gE~-/VP22-P1/2A/3C疫苗免疫组,其FMDV的ELISA抗体水平均与FMDV灭活疫苗免疫组的抗体水平相当,显著不差异(P＞0.05),说明利用伪狂犬病毒融合表达VP22-P1和VP22-P1/2A/3C能激发很好的免疫反应。综上所述,本研究成功构建了融合表达牛疱疹病毒Ⅰ型VP22基因与O型口蹄疫病毒P1基因或P1/2A/3C基因的DNA疫苗和重组伪狂犬病毒重组疫苗,并利用Balb/c小鼠为模型对不同疫苗的免疫原性进行了比较,为口蹄疫新型疫苗的研究提供了基础。