肌肉酸楚、关节疼痛是人们在现代化的都市生活中经常面临的病证之一,近年来,颈肩腰腿痛的发病率逐年增高,肌肉、关节疼痛的治疗已经成为一个公众性的健康问题。西医高效治疗疼痛的同时,带来诸多的不良反应,给患者带来新的痛苦,治疗的社会成本和经济成本较高。中医药治疗肌肉、关节疼痛具有方法灵活、疗效显著、不良反应相对较小,并且价格相对较低的特点。丁桂活络膏(批准文号：川药制字Z20080855)是四川省骨科医院郑氏伤科治疗各类疼痛最常用的制剂之一,临床应用三十余年,治疗颈肩腰腿疼痛,以及跌打损伤、运动创伤、软组织损伤中后期的各类疼痛疗效显著。本课题在国家科技部“科研院所技术开发研究专项”项目(2012EG145135)的资助下,结合长期临床应用基础,在前期提取工艺的基础上,针对颈肩腰腿痛临床治疗特点,在中医药理论的指导下,将传统中医药和现代经皮给药理论相结合,研制成疗效独特、使用方便、不良反应小、无创伤给药的新型中药复方经皮给药制剂——丁桂凝胶膏剂。本论文主要从处方基质、促透剂、成型工艺、质量标准、稳定性、皮肤安全性、初步药效学等方面进行研究。1丁桂凝胶膏剂基质处方与成型工艺条件研究1.1丁桂凝胶膏剂基质骨架的选择以外观评价、初黏力、持黏力、剥离强度为评价指标,结合凝胶时间,对几种常用的骨架成分进行了比较研究,筛选出NP-700作为本处方的骨架成分。1.2以NP-700为骨架的基质处方研究以外观评价、初黏力、持黏力、剥离强度为评价指标,采用单因素法进行了丁桂凝胶膏剂基质的初步筛选,确定了NP-700、卡波姆、酒石酸、甘油的较适宜用量范围,采用正交设计等方法,优选出丁桂凝胶膏剂的基质处方为：NP-700：甘羟铝：EDTA:高岭土：PVPP：甘油：卡波姆：PVP：酒石酸：蒸馏水：浸膏=6：0.24：0.1：5：2：30：0.1：2：0.2：49.36：5。经验证,该配方制备的丁桂凝胶膏剂外观美观、黏性较好。1.3成型工艺条件考察以外观评价与黏性评价为指标,考察丁桂凝胶膏剂成型工艺中的搅拌速率、搅拌时间等条件,优选出成型工艺：将NP-7006g、甘羟铝0.24g、 EDTA0.1g、高岭土5g、PVPP2g加入甘油30g中搅拌均匀,再加入浸膏5g为A相,将卡波姆0.1g、VP2g溶于蒸馏水49.36g中过夜使充分溶胀,再向其中加入酒石酸0.2g为B相,将B相缓缓加入A相中,在常温下,先以150r/min的速度搅拌3mmin,再以100r/min的速度搅拌27min,总搅拌时间为30mmin,制成的凝胶膏剂外观与黏性俱佳。2丁桂凝胶膏剂促透剂的筛选研究经皮给药制剂吸收的最大障碍是皮肤对药物渗透的屏障作用,因此,对于经皮给药制剂的研究,选择理想的透皮吸收促进剂以使足够量的药物进入人体内从而起到治疗作用具有重要意义。2.1丁桂凝胶膏剂体外经皮渗透试验方法的建立通过考察不同动物皮肤与人造皮肤Strat-M膜、不同接收介质、不同实验温度对丁桂凝胶膏剂君药羌活中的主要有效成分羌活醇的体外经皮渗透行为的影响,建立了丁桂凝胶膏剂中羌活醇的体外经皮渗透的实验方法：采用Strat-M膜为透皮屏障,30%的乙醇生理盐水为接收介质,实验温度37℃,磁搅拌转子转速600r/min。2.2不同促透剂对丁桂凝胶膏剂中羌活醇体外经皮渗透的影响采用单因素考察法考察了0.5%、1%、2%、3%、4%、5%氮酮,2%、4%、6%、8%、10%丙二醇,0.25%、0.5%、1%、1.5%、2%薄荷脑对丁桂凝胶膏剂体外透皮吸收的影响,结果显示氮酮(0.5%-2%)、丙二醇(4%-8%)、薄荷脑(0.5%-1.5%)在一定比例范围内对丁桂凝胶膏剂中羌活醇具有不同程度的促透作用,且对丁桂凝胶膏剂的外观、黏性不造成严重影响,油酸、NMP不适合用作丁桂凝胶膏剂的促透剂。2.3正交实验设计优选丁桂凝胶膏剂中的复合促透剂根据氮酮、丙二醇、薄荷脑的单因素考察结果,以外观评分、黏性评分、羌活醇累积透皮率为指标,采用加权综合评分法,运用正交实验设计法优选了复活促透剂,结果显示,由氮酮(0.5%)-丙二醇(8%)-薄荷脑(1.5%)组成的复合促透剂对丁桂凝胶膏剂的外观与黏性影响较小,而促进透皮吸收的性能优于单种促透剂的使用。通过与丁桂活络膏橡胶膏剂的体外透皮试验对比研究,显示凝胶膏剂的透皮吸收性能明显优于橡胶膏剂。3丁桂凝胶膏剂的工艺放大试验研究结合大生产中的实际情况,对实验室确定的制备工艺进行了放大试验,确定丁桂凝胶膏剂的制备工艺为：将NP-7006g、甘羟铝0.24g、EDTA0.1g、高岭土5g、PVPP2g加入甘油30g中搅拌均匀,再加入浸膏5g为A相,将卡波姆0.1g、 PVP2g溶于蒸馏水49.36g中过夜使充分溶胀,再向其中加入酒石酸0.2g为B相,将B相缓缓加入A相中,在常温下,先以150r/min的速度搅拌3min,再以100r/min的速度搅拌27min,总搅拌时间为30min,涂布于无纺布上,盖上PE压花膜,切割,保存。4丁桂凝胶膏剂的质量标准研究根据《中国药典》现行版一部附录贴膏剂项下凝胶膏剂的制剂通则和要求,制定了丁桂凝胶膏剂的质量标准。采用薄层色谱法对羌活、延胡索、独活、木香、丁香、肉桂、当归、川芎、白芷进行了定性鉴别,结果显示,鉴别方法简便、可靠、专属性强、阴性无干扰。对含膏量、赋形性、黏附性、微生物限度检查项目进行了研究,规定丁桂凝胶膏剂每100cm2含膏量应不少于10.0g,黏附性测试照《中国药典》现行版一部附录Ⅻ E项下第一法、第二法、第三法测定,初黏力测试丁桂凝胶膏剂应能粘住4号钢球,持黏力测试丁桂凝胶膏剂1h内位移距离不应超过4.0cm,剥离强度测试丁桂凝胶膏剂的1800剥离强度应不低于0.04kN/m。采用高效液相色谱法对丁桂凝胶膏剂中羌活醇、延胡索乙素的含量测定进行研究,根据研究结果,规定本品每片含羌活以羌活醇(C21H2205)计不得少于0.7mg,含延胡索以延胡索乙素(C21H25NO4)计不得少于0.18mg。从而为控制丁桂凝胶膏剂的内在质量提供了可靠依据。5丁桂凝胶膏剂的稳定性研究按照拟定的质量标准草案对三批丁桂凝胶膏剂采用纸铝复合包装,以丁桂凝胶膏剂的外观性状、鉴别,含膏量、黏附性、微生物检查以及丁桂凝胶膏剂中羌活醇、延胡索乙素的含量测定等为考核指标,进行了6个月的加速稳定性试验和长期稳定性试验,初步考察丁桂凝胶膏剂的稳定性。结果表明丁桂凝胶膏剂在样品包装条件下,三批样品在温度40℃±2℃、相对湿度75%±5%的条件及温度25℃±2℃、相对湿度60%±10%的条件下分别考察6个月,外观无变化,鉴别均呈正反应,检查、含膏量、黏附性、含量测定合格,微生物检查检查符合规定。说明样品6个月内稳定。6丁桂凝胶膏剂和丁桂活络膏的体外透皮吸收对比研究丁桂凝胶膏剂和丁桂活络膏的体外透皮试验对比研究结果显示,丁桂凝胶膏剂48h累积透皮率为65.62%,透皮速率为1.37%/h,丁桂活络膏48h累积透皮率为30.88%,透皮速率为0.643%/h。在第2、4、6、8、12、24、48h,凝胶膏剂的累积透皮率分别为丁桂活络膏的1.22、1.21、1.51、1.57、1.76、2.14、2.12倍,2h～48h期间,丁桂凝胶膏剂的整体透皮速率约为丁桂活络膏的2倍,48h内丁桂凝胶膏剂累积透皮率约为64%。丁桂凝胶膏剂的透皮吸收效果较丁桂活络膏更好。7丁桂凝胶膏剂的安全性实验研究通过皮肤刺激性实验研究可知,以日本大耳白家兔为研究对象,丁桂凝胶膏剂单次或连续用药时,家兔皮肤均未观察到水肿、色素沉着、渗血点、皮肤菲薄、体重异常,丁桂凝胶膏剂不会引起家兔皮肤的刺激反应；通过皮肤过敏性实验研究可知,以白色皮毛豚鼠为研究对象,丁桂凝胶膏剂反复给药后,不会引起豚鼠皮肤局部过敏反应,亦无全身性的不适反应,未发现丁桂凝胶膏剂有明显致敏作用。8丁桂凝胶膏剂的初步药效学研究通过考察丁桂凝胶膏剂对醋酸致小鼠扭体反应、对热板刺激小鼠疼痛反应以及对福尔马林对小鼠的致痛实验的影响,初步认为丁桂凝胶膏剂有明显的镇痛作用。丁桂凝胶膏剂高剂量组、等效剂量组、丁桂活络膏组均可不同程度地抑制热板刺激引起的小鼠疼痛反应,且在用药90min后作用明显增强(P<0.05)。丁桂凝胶膏剂高剂量组、等效剂量组、丁桂活络膏组均能明显对抗福尔马林导致的Ⅰ相神经疼痛、Ⅱ相炎性疼痛反应(P<0.05)。但丁桂凝胶膏剂各剂量组与丁桂活络膏组对扭体反应次数的改变与对照组相比无显著性差异。通过抗炎实验发现,丁桂凝胶膏剂各剂量组仅有对抗二甲苯致小鼠耳肿胀的作用趋势,与模型组比较均无显著性差异。丁桂凝胶膏剂高剂量组与等效剂量组均能一定程度地降低角叉菜胶对大鼠足肿胀的影响(P<0.05)。通过上述实验研究,初步认为丁桂凝胶膏剂有一定的镇痛、抗炎作用。9丁桂凝胶膏剂镇痛、抗炎作用机理初步研究通过考察丁桂凝胶膏剂对福尔马林致痛模型小鼠血清中IL-1与TNF-α含量的影响,初步认为丁桂凝胶膏剂高剂量组能显著降低模型动物血清中的IL-1含量(P<0.05),丁桂凝胶膏剂高剂量组、等效剂量组及丁桂活络膏组能显著降低模型动物血清中的TNF-α含量(P<0.05,P<0.01)。通过考察丁桂凝胶膏剂对角叉菜胶足肿胀模型大鼠血清中IL-1与TNF-α含量的影响,初步认为丁桂凝胶膏剂各剂量组及丁桂活络膏组具有降低模型动物血清中IL-1含量的趋势,丁桂凝胶膏剂高剂量组及丁桂活络膏组能显著降低模型动物血清中的TNF-α含量(P<0.05)。通过考察丁桂凝胶膏剂对佐剂关节炎模型大鼠左、右后足踝关节周长,以及血清中IL-1、TNF-a、IgG、IgM、5-HT、PGE2、NO含量的影响,初步认为丁桂凝胶膏剂高剂量组、等效剂量组、丁桂活络膏组对上述指标有一定的影响,表现为：丁桂高剂量组、丁桂等效剂量组及丁桂活络膏组对模型大鼠右、左后足踝关节的异常肿胀有改善作用,丁桂高剂量组对模型大鼠IgG含量的增加有显著性改善(P<0.05),丁桂高剂量组、丁桂等效剂量组与丁桂活络膏组对模型大鼠NO含量的增加仅有降低趋势而无显著性差异。通过对丁桂凝胶膏剂镇痛、抗炎作用机理进行初步研究得出,药物抗炎、镇痛作用的发挥可能与降低福尔马林致痛模型与角叉菜胶足肿胀模型动物血清中IL-1与TNF-α的含量,以及降低佐剂关节炎模型动物血清中IL-1、IgG、IgM、NO等因子的含量有关。