丹参(Salvia miltiorrhiza)是我国传统大宗药材之一,对治疗心血管疾病具有显著疗效,丹参活性成分主要为丹酚酸类和丹参酮类化合物,茉莉酸(JA)可以显著促进丹参活性成分的积累,通过JA生物合成的调控可能影响丹参活性成分积累,也可为提升药材品质提供新的思路和途径。尽管JA的生物合成途径已经明确,但对于丹参中JA生物合成的调控机制知之甚少。本研究首先克隆了丹参JA生物合成的关键酶基因——丙二烯氧化合酶基因(SmAOS)及其启动子,以启动子为诱饵,通过酵母单杂交筛选丹参c DNA文库,获得了与之互作的4个转录因子,以其中的SmbHLH74为研究对象,利用酵母单杂(Y1H)、凝胶迁移阻滞(EMSA)、染色质免疫共沉淀(ChIP-q PCR)以及双荧光素酶报告基因(Dual-LUC)等试验,证明了SmbHLH74调控SmAOS转录参与JA生物合成的分子机制,主要结果如下:1.从丹参中克隆了SmAOS基因,其CDS为1599bp,编码532个氨基酸;它在根中高水平表达,茎和叶表达水平很低,外源Me JA处理可快速诱导SmAOS表达;亚细胞定位试验表明SmAOS定位在叶绿体上。2.构建了SmAOS的过量表达载体,通过发根农杆菌和根癌农杆菌介导的遗传转化,经鉴定后获得了少量再生植株和毛状根;再生芽难以生根,毛状根生长缓慢,转基因植株容易褐化死亡,推测是由于JA含量升高,严重抑制了根的生长。3.克隆了SmAOS的启动子2079bp,以启动子为诱饵,酵母单杂交筛选丹参c DNA文库,获得了与之互作的两个WRKY和两个b HLH转录因子,以其中的SmbHLH74为主要研究对象。4.为进一步地分析SmbHLH74对SmAOS的转录调控,通过Y1H、EMSA、ChIP-q PCR以及Dual-Luc报告系统等试验,发现SmbHLH74直接结合SmAOS的启动子并抑制其转录;并且SmbHLH74过量表达的植株中,SmAOS表达量下调,JA含量显著降低。综上,本研究证明了丹参中SmbHLH74直接结合SmAOS的启动子并抑制其转录,从而负调控茉莉酸生物合成的分子机制。