人表皮细胞培养及细胞膜片在供皮区应用的研究 大面积烧伤病人及皮肤病患者的临床治疗对皮肤组织的需求一直很大，但临床上能够获得的供体皮肤组织十分有限。传统的治疗方法是移植自体皮，这常常导致供皮区色素改变，瘢痕形成。1975年Green等人首先培养成功人工皮肤组织的表皮细胞，并成功地用于皮肤缺损创面的治疗，成为烧伤治疗领域的一个里程碑。 经过几十年的发展，现在已有公司开发出了商品化的皮肤，这些皮肤都是由皮肤细胞和不同的基质材料构成。构建皮肤组织时需要大量的成纤维细胞和表皮细胞等种子细胞，所以皮肤种子细胞的培养是当前皮肤组织工程中一个重要的研究课题。至今，成纤维细胞的培养技术已经日臻完善，但角质细胞的培养仍然是一个难题。角质细胞中能够增殖的主要是表皮干细胞和短暂扩充细胞，占表皮基底层细胞数目总数的1％-10％，而表皮干细胞是一种定向干细胞，体外培养很容易分化，而且寿命很短。 表皮细胞分离培养技术的第一步就是要从皮肤中分离基底层细胞。迄今为止，表皮基底层细胞的分离都是用pH值7.2～7.4的中性蛋白酶或(和)胰蛋白酶溶液消化分离法。培养方法有滋养层培养、无滋养层培养和气液界面培养等，培养基有血清培养基和无血清培养基。表皮细胞临床应用的方法有单纯细胞膜片移植、表皮细胞与各种真皮基质结合的复合移植。但是要获得更多能增殖的角质细胞及更快培养出可以临床应用的表皮细胞，还是有难度的。本实验将着眼于异体表皮细胞分离、优化血清培养和传代条件以及人纤维蛋白胶为载体的气液界面培养表皮细胞膜片在供皮区临床应用移植的相关研究。 第一部分 pH值对人表皮基底层细胞分离及培养的影响 目的 观察中性蛋白酶和胰蛋白酶联合热消化分离表皮基底层细胞过程中，pH值对表皮分离的影响。观察不同时间点的表皮分离情况并评分记录，得到表皮完第二军医大学中文摘要学位论文全分离的最短时间。观察分离细胞的培养生长情况。方法分别用3种pH值水平的中性蛋白酶在37℃条件下消化分离全厚皮的表皮，分离过程中对分离状况进行观察、评分并记录。至其中有一组表皮完全分离的时候，将各组各观察时间点的评分求和，并进行比较。分离的表皮和真皮做病理切片观察基底层分离情况。分离的表皮继续用相同的胰蛋白酶消化分离得到表皮基底层细胞。用台盼蓝染色检测细胞活性。然后SP法染色，用K一19抗体标记分离的基底层干细胞，计数染色阳性细胞，并比较。将各组细胞按相同条件分别接种培养，考察其生长增殖能力。结果中性蛋白酶消化90min时记录的表皮分离状况平均累积积分分别为9.625士0.629、10.375士0.946、5.75士0.645，此时pH值为6一7的中性蛋白酶己经可以将表皮和真皮完全分离。3组分离的表皮分别经0.25%胰蛋白酶在37℃下进一步分离得到的基底层细胞。所得的细胞用台盼蓝染色计算细胞活性分别为81%、85.25%、86%。进一步培养结果显示，各组细胞的生长增殖能力无明显差异。结论pH值为6一7的0.25%中性蛋白酶联合0.25%胰蛋白酶热消化分离表皮基底层细胞的时间为90分钟左右。比常规方法的分离时间少了近30分钟。而且分离得到基底层细胞的活力和生长增殖能力与常规方法相比无明显差异。因此，我们认为采用在37℃条件下pH值为6一7的0.25%中性蛋白酶联合0.25%胰蛋白酶消化分离表皮基底层细胞的速度快，细胞生长增殖能力正常。第二部分优化表皮细胞血清培养和传代条件目的采用DF12血清培养基系统，调节其中钙离子浓度，观察不同钙离子浓度状况下表皮细胞的生长情况;比较用0.25%中性蛋白酶和0.2%EDTA溶液作为消化液进行传代与传统的0.25%胰蛋白酶溶液传代方法进行比较。方法测定四种不同配比的DF12培养基和小牛血清的生化指标，计算出各种配制培养基的钙离子浓度。调节培养液的钙离子浓度，镜下观察对比四种不同培养基培养的传代表皮细胞生长情况;将用0.25%中性蛋白酶和0.2%EDTA溶液消化传代的细胞与0.25%胰蛋白酶溶液传代细胞进行培养，计算细胞活性、贴壁率、克隆形成率;测定细胞增殖活力及制作细胞生长曲线，按XTT细胞增殖测定试剂盒操作方法，以酶联免疫检测仪于450lun波长测定光吸收值(OD值)，根据第二军医大学中文摘要学位论文OD值制作反映细胞增殖活力的细胞生长曲线。采用碘化丙淀一步荧光染色法流式细胞仪检测表皮细胞的细胞周期，对比各个细胞周期阶段的细胞比率，分析细胞的增殖能力。结果各种血清培养基钙离子浓度分别是:2.40(DMEM)、1.58(D压一l/l)·l·30(ozF=l/2)、1 .15(o用=1 23)、0.53(rlZ)mmol八。用这四种培养基培养传代的表皮细胞贴壁率分别是(32.43土17.94)%(DMEM)、(34.50士18.47)%(D/F二l/l)· (38.67士20.69)%(D邝二l/2)、(46.23士24.72)%(o用=l/3);克隆形成率分别是:0.31士0.09、0.33士0.13、0.34士0.12、0.47士0.16;成膜时间分别是:9.25、8.25、8.25、8.25、7.25天。0.25%胰蛋白酶溶液传代表皮细胞的贴壁率、克隆形成率、成膜时间、Gl%分别是:(38.67士20.69)%、0.34士0.14、8.5、72.88%;0.25%中性蛋白酶+02%EDTA溶液传代?