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1.目的:
1.从B95-8细胞中获得EB病毒潜伏膜蛋白2A(EBV-LMP2A)全长编码区基因序列。
2.EBV-LMP2A N端1-119位氨基酸(EBV-LMP2A1-119)的基因克隆及其原核蛋白表达与纯化:构建含EBV-LMP2A1-119的原核重组质粒PGEX/EBV-LMP2A1-119,经IPTG诱导后用Western Blot进行特异性鉴定。采用Ni-NTA树脂亲和层析法纯化融合蛋白EBV-LMP2A1-119,进行动物免疫制备小鼠免疫血清,用于下续研究。
3.EBV-LMP2A基因重组慢病毒载体的构建及体外表达鉴定:构建慢病毒重组质粒CFUGW/EBV-LMP2A/EGFP和CFUGW/EBV-LMP2A,转染COS-7细胞,经RT-PCR、直接荧光(间接免疫荧光)、Western Blot分析证实EBV-LMP2A目的蛋白的表达。
方法：
1.提取EBV标准株(B95-8细胞)总RNA,通过逆转录获得cDNA,并设计特异性引物,扩增获得EBV-LMP2A全长基因。
2.将获得的EBV-LMP2A1-119基因序列插入原核表达载体PGEX-4T-1,并在EBV-LMP2A1-119基因序列末端加上6×His标签以便于纯化,构建含有His标签的重组质粒PGEX/EBV-LMP2A1-119,经IPTG诱导表达后的蛋白进行SDS-PAGE电泳,并用His单克隆抗体作为一抗通过Western Blot初步验证目的蛋白的表达。用Ni-NTA树脂亲和层析法纯化融合蛋白EBV-LMP2A1-119。将纯化后的融合蛋白与佐剂等体积混匀后按照50μg/只剂量免疫BALB/c小鼠,采用背部皮下多点注射的方法,共免疫三次,免疫后断尾取血,采用ELISA法检测血清中特异性IgG。
3.将获得的EBV-LMP2A全长基因序列插入慢病毒载体CFUGW,分别构建重组质粒CFUGW/EBV-LMP2A/EGFP和CFUGW/EBV-LMP2A,利用脂质体转染COS-7细胞,提取转染后细胞的RNA通过RT-PCR法证明目的基因的表达。重组质粒CFUGW/EBV-LMP2A/EGFP转染后的COS-7细胞荧光显微镜下直接观察荧光,间接验证目的基因的表达。重组质粒CFUGW/EBV-LMP2A则通过转染COS-7细胞,利用间接免疫荧光的方法验证目的基因的表达。提取转染上述两种重组质粒的COS-7细胞蛋白通过Western Blot方法进一步检测目的蛋白的表达。
结果：
1.提取EBV标准株(B95-8细胞)总RNA,通过RT-PCR获得了EBV-LMP2A编码区基因序列,经测序比对与SwissProt,蛋白质数据库(P13285)的序列完全一致。
2.酶切鉴定和核苷酸测序结果表明,成功构建了含有EBV-LMP2A1-119基因序列的原核重组质粒PGEX/EBV-LMP2A1-119。在37℃,1.0mM IPTG作用下诱导5h能很好地表达目的蛋白,经SDS-PAGE分析相对分子量为50kDa。Western Blot结果显示,以His单克隆抗体作为一抗,则可见单一明显条带,与SDS-PAGE中位置吻合。用Ni-NTA树脂亲和层析法纯化得到融合蛋白EBV-LMP2A1-119。BALB/c小鼠经融合蛋白EBV-LMP2A1-119免疫后,经ELISA检测证实,获得了具有较高效价的特异性IgG免疫血清。
3.成功构建了慢病毒重组质粒CFUGW/EBV-LMP2A/EGFP和CFUGW/EBV-LMP2A,转染COS-7细胞后经RT-PCR检测,均可检测到约1500bp大小的片段,与目的基因EBV-LMP2A大小一致。转染CFUGW/EBV-LMP2A/EGFP的COS-7细胞在荧光显微镜下可直接观察到荧光。转染CFUGW/EBV-LMP2A的COS-7细胞通过间接免疫荧光的方法在共聚焦显微镜下可观测到荧光。经Western Blot分析,上述两种重组质粒均可转染COS-7细胞表达54Kda的EBV-LMP2A蛋白。
结论：
1.成功获得EBV-LMP2A编码区全产基因序列。
2.通过分子克隆技术,成功构建了含EBV-LMP2A1-119。的重组质粒PGEX/EBV-LMP2A1-119,在原核表达系统中表达了含EBV-LMP2A1-119。的融合蛋白,通过亲和层析法得到了纯化的EBV-LMP2A1-119融合蛋白,经EBV-LMP2A1-119融合蛋白免疫BALB/c小鼠,获得了特异性的免疫血清。
3.通过分子克隆技术,成功构建了含EBV-LMP2A的重组质粒CFUGW/EBV-LMP2A/EGFP和CFUGW/EBV-LMP2A,转染哺乳动物细胞COS-7后,通过RT-PCR、直接荧光(间接免疫荧光)检测和Western Blot方法证明,上述两种重组质粒均可在真核细胞中表达EBV-LMP2A的蛋白.