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目的1.观察Kindlin-2RNA干扰对大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖、迁移和黏附的影响并探讨可能的分子机制和相关的信号转导通路。2.探讨Kindlin-2RNA干扰对大鼠颈动脉球囊损伤后内膜增生的影响及可能的作用机制。方法1.依据大鼠Kindlin-2基因序列和RNA干扰序列设计原则,设计3个RNA干扰靶序列并选择一条最有效的靶序列,合成单链DNA oligo并退火配对形成双链,再通过酶切位点连接到慢病毒载体上,然后将产物转入细菌感受态细胞,PCR技术鉴定阳性重组子并测序验证。最后使用293T细胞包装慢病毒载体,收获的慢病毒进行浓缩和滴度测定。2.采用组织块贴壁法原代培养大鼠VSMCs并使用α-actin抗体鉴定,取3-6代细胞进行实验。用制备好的Kindlin-2siRNA慢病毒载体感染大鼠VSMCs,感染复数为100,细胞免疫荧光检测VSMCs中Kindlin-2和β1整合素的表达；CCK-8和BrdU技术检测重组Wnt3a蛋白(100ng/ml)诱导的VSMCs增殖情况；实时定量PCR测定VSMCs中Kindlin-2, c-myc和cyclinDl mRNA的表达水平；免疫共沉淀了解Kindlin-2和β-catenin的关系；Western blot检测VSMCs中Kindlin-2, β-catenin,磷酸化β-catenin(Ser675), GSK-3β和磷酸化GSK-3p(Ser9)蛋白的表达并分析。3. Kindlin-2siRNA慢病毒载体感染培养的大鼠VSMCs,通过Transwell和细胞划痕实验了解VSMCs的迁移能力,细胞基质黏附实验了解VSMCs黏附细胞外基质的能力,实时定量PCR和Western blot测定VSMCs中Kindlin-2和p1整合素mRNA及蛋白表达水平,流式细胞技术检测VSMCs表面总β1整合素和激活的p1整合素的表达。4.健康雄性SD大鼠随机分为三大组：假手术组、阴性对照组和Kindlin-2组。制作大鼠颈动脉球囊损伤模型,并用Kindlin-2siRNA慢病毒感染颈动脉,1周和4周后取损伤的颈动脉,实时定量PCR检测Kindlin-2mRNA的表达,HE染色评估术后4周颈动脉内膜增生情况,并行免疫荧光或免疫组化检测颈动脉中Kindlin-2、α-actin、 PCNA和p1整合素的表达,Masson染色了解颈动脉中胶原纤维合成情况。结果1.PCR鉴定重组后的阳性克隆与预期结果相符,测序图谱清晰可读,扩增的序列与设计的Kindlin-2RNA干扰序列完全一致。293T细胞包装的慢病毒经浓缩后滴度接近1x109TU/ml,达到实验要求。2. Kindlin-2siRNA慢病毒能有效的感染VSMCs,并可以改变VSMCs中Kindlin-2和β1整合素的亚细胞分布。Kindlin-2RNA干扰能够显著抑制Wnt3a诱导的VSMCs增殖(P<0.05)。与空白对照组和阴性对照组相比,Kindlin-2RNAi组和Kindlin-2RNAi+Wnt3a组中Kindlin-2, c-myc和cyclinD1mRNA表达水平均明显下降(P<0.05)。免疫共沉淀证实VSMCs中Kindlin-2可以与β-catenin结合,而且Kindlin-2RNA干扰可以显著降低VSMCs中Kindlin-2,磷酸化β-catenin(Ser675)和磷酸化GSK-3p(Ser9)蛋白的表达水平(P<0.05)。3. Kindlin-2RNA干扰明显降低VSMCs中Kindlin-2mRNA和蛋白表达水平(P<0.05),并能显著抑制VSMCs的迁移和黏附能力(P<0.05),但对β1整合素mRNA和蛋白的表达没有明显影响(P>0.05),却能影响VSMCs表面β1整合素的激活(P<0.05)。4. Kindlin-2RNA干扰能明显降低1周时颈动脉中Kindlin-2mRNA的表达水平(P<0.05),并显著抑制4周后颈动脉的内膜增生(P<0.05)。与阴性对照组相比,Kindlin-2组术后4周颈动脉中Kindlin-2. a-acti、PCNA和p1整合素的表达水平均明显降低,颈动脉内膜和中膜胶原纤维的合成也减少。结论1.合成的Kindlin-2RNA干扰序列可以构建有效的慢病毒载体。2. Kindlin-2RNA干扰可以通过Wnt/β-catenin信号通路发挥作用并抑制VSMCs增殖。3. Kindlin-2可以通过p1整合素的活性调节VSMCs迁移和黏附。4. Kindlin-2RNA干扰可能通过抑制VSMCs增殖、迁移和细胞基质黏附减轻血管内膜增生。