盐地碱蓬是一种叶肉质化的稀盐盐生植物,在进化中可能形成了特殊耐盐机制。大量的研究表明,植物耐盐性通常与有效的抗氧化系统呈正相关,盐生植物和甜土植物在活性氧解毒机制上可能存在显著的差异。因此,从盐生植物盐地碱蓬中克隆活性氧清除酶类基因并分析其功能,可能有助于理解植物中盐胁迫的耐受机制。越来越多的实验证明,盐胁迫诱导植物体内活性氧（O₂·^ˉ、H₂O₂、OH·等）产生的增加,引起氧化胁迫。其中O₂·^ˉ和H₂O₂在盐对植物的伤害机制中起着主要作用。O₂·^ˉ主要由超氧化物歧化酶（SOD）通过歧化反应形成H₂O₂和O2而进行清除,SOD在降低O₂·^ˉ毒害的同时却增加了细胞内H₂O₂的含量,除此之外细胞内一些酶促或非酶促反应也能产生H₂O₂,H₂O₂在过渡金属存在下可转化为氧化活性更高的OH·。因此,植物能否有效地清除逆境下产生的O₂·^ˉ和H₂O₂对其抗逆性至关重要。本实验比较系统地研究了高浓度NaCl处理下,盐地碱蓬叶片中清除O₂·^ˉ和H₂O₂的各种酶（SOD、CAT、APX）的活性,并结合其它生理指标阐明它们在盐地碱蓬耐盐性中的作用,旨在了解盐地碱蓬的耐盐性与O₂·^ˉ和H₂O₂清除系统的关系,进一步完善盐生植物的耐盐与抗氧化之间的关系机理,在此基础上我们克隆了盐地碱蓬叶绿体APX,并分析了其在高光强诱导的氧化胁迫中的作用,结果如下:1.NaCl处理对盐地碱蓬生长状况和光合作用的影响盐地碱蓬整株鲜重在200 mmol/L NaCl处理后与对照的差异达到极显著水平为对照的154.8%（P<0.01）,Pn的变化与它们的整株鲜重变化相一致,达到对照的140.2%（P<0.05）,盐胁迫并没有降低盐地碱蓬叶片的Pn,甚至还促进光合作用,这说明盐地碱蓬在高盐环境中仍能正常生长,且长势好于正常环境中的,这与非盐生植物不同。2.盐处理对盐地碱蓬叶片MDA（丙二醛）含量和质膜透性的影响在200 mmol/L NaCl处理七天后,盐地碱蓬叶片中MDA含量与对照相比变化不显著（P>0.05）,质膜透性也无明显差异（P>0.05）。这在一定程度上可以说明盐浓度达到200 mmol/L时,盐地碱蓬叶片细胞膜还没有受到损伤,这意味着盐地碱蓬具有很强的抵抗盐胁迫诱导的氧化胁迫的能力。3.盐处理对盐地碱蓬叶片中抗氧化酶系统的影响盐地碱蓬叶片中的SOD、CAT、APX是清除O₂·^ˉ和H₂O₂的最基本的酶类,盐处理后他们的活性都有不同程度的改变。SOD活性增加为对照的107.6%,清除H₂O₂的酶CAT和APX的活性则显著高于对照（P<0.05）。叶绿体中SOD主要分布于类囊体膜和叶绿体基质中,其中叶绿体类囊体膜结合型的SOD占主导地位。200 mmol/L NaCl处理后,类囊体膜SOD、基质SOD的活性均有上升的趋势,这种变化趋势与整个细胞中SOD活性的变化趋势是一致的。APX在叶绿体中的分布,至少有一半是结合在类囊体膜上的,而叶绿体基质中可溶性APX占到整个细胞中可溶性APX的74%～85%,可见,盐地碱蓬叶片中可溶性APX大部分分布在叶绿体中,这是与叶绿体中没有CAT以及叶绿体是绿色细胞中活性氧产生的最主要的细胞器相适应的,有利于及时清除叶绿体中产生的H₂O₂,尤其是H₂O₂的原位清除。盐处理后盐地碱蓬叶绿体中APX的活性显著升高（P<0.05）。4.盐地碱蓬CHLAPX基因克隆及序列分析利用简并PCR和5’、3’-RACE克隆得到了盐地碱蓬叶绿体APX基因,命名为CHLAPX,这一个基因通过选择性剪接产生两种不同的mRNA分别编码两种蛋白:叶绿体基质型APX（Ss.sAPX）和叶绿体膜结合型APX（Ss.tAPX）,他们N末端的氨基酸序列是完全一样的,只是在Ss.tAPX C末端多出49个氨基酸。疏水性分析表明盐地碱蓬Ss.tAPX的C末端有一个跨膜区,大约有22个氨基酸残基（氨基酸404-426）,它能使该酶跨过基质中的类囊体膜,在Ss.sAPX中没有这样的跨膜区。利用TargetP软件分析,盐地碱蓬CHLAPX的N末端有一个大约为64个残基的导肽,导肽与GFP的融合蛋白定位于叶绿体中。5.盐地碱蓬CHLAPX基因的表达特性分析盐胁迫明显诱导了盐地碱蓬CHLAPX基因表达,400 mmol/L NaCl处理盐地碱蓬,地上部分处理24小时表达量达到最大,而后,随处理时间的进一步延长（24-48 h）,CHLAPX基因表达量逐渐降低,但直到处理48 h,CHLAPX基因表达量仍明显高于对照。而地下部分CHLAPX基因表达量则随处理时间的延长一直呈上升趋势。对盐地碱蓬植株进行200、400 mmol/L NaCl处理48 h,在200 mmol/L NaCl诱导下CHLAPX在盐地碱蓬地上部分表达量显著增加,表达量远远高于400 mmol/L NaCl诱导下的,地下部分的CHLAPX的表达量则随处理浓度的增加而增加,这说明地上部分和地下部分CHLAPX表达模式还是有些差异。6.盐地碱蓬CHLAPX基因功能分析在正常生长条件下,野生型和转基因植株没有明显差异,高光强处理拟南芥离体叶片后,野生型和转sAPX、tAPX基因植株叶片的MDA含量都增加了（图21）,相比之下,转基因植株增加的程度远远小于野生型的（P<0.05）,叶片相对电导率都低于野生型的,但没有达到显著差异的水平,MDA含量和电导率结果基本上是一致的,都表明转sAPX、tAPX基因植株细胞膜受氧化损伤程度低。高光强处理后,转sAPX、tAPX基因植株的Fv/Fm和叶绿素含量都高于野生型,进一步说明转基因植株比野生型更抗高光胁迫。为了进一步探究转基因植株抗高光胁迫的原因,本实验还测定了一系列抗氧化酶如SOD、CAT、APX的活性。在正常条件下,野生型和转sAPX、tAPX基因植株叶片中SOD、CAT的活性没有差异,转sAPX植株两个株系叶片中APX活性分别是野生型的1.48和1.58倍,但转tAPX植株叶片中APX活性与野生型的没有明显差异,只有一个增加的趋势,究其原因可能是tAPX是膜结合型蛋白,并没有完全溶解在提取缓冲液里,没有检测到。高光强处理后,叶片中SOD、CAT、APX活性变化一致,他们的活性都明显高于野生型的,一个抗氧化酶基因的导入,引起一系列抗氧化酶活性的改变,说明他们在抗氧化过程中是相互协调作用的。7.盐地碱蓬胞质CAT超表达于拟南芥叶绿体中的功能分析在正常生长条件下,野生型和转s+CAT基因植株表型无差异。高光处理后,转基因植株MDA含量、叶片的相对电导率、叶绿素含量以及PSⅡ反应中心最大光能转化效率Fv/Fm都要明显高于野生型的,这些结果说明将CAT导入叶绿体中提高了拟南芥对高光胁迫的抗性。检测转基因植株内抗氧化酶活性发现,转基因植株叶片中SOD、APX活性与野生型的无明显差异,只是略低于野生型的,而CAT的活性却明显低于野生型的。高光处理后,对于转基因植株中这三种抗氧化酶的活性却表现出一致性的变化:都明显高于野生型的。这可能是此转基因株系抗高光胁迫的一个原因。总之,本实验克隆出了一个盐生植物叶绿体APX的基因CHLAPX。它的N-末端有一个叶绿体定位信号肽,通过选择性剪接产生两种不同的mRNA分别编码两种蛋白。NaCl处理条件下,盐地碱蓬叶绿体中APX的表达量和活性都显著增加,初步认为盐生植物盐地碱蓬在盐胁迫下叶绿体APX在维持胞内ROS的产生和清除平衡过程中起重要作用。转CHLAPX基因植株在高光强下抗性明显高于野生型,说明CHLAPX对植株高光条件下某些生理反应特别是植物对高光诱导产生的氧化胁迫是至关重要的。