急性髓系白血病是常见的血液系统恶性肿瘤,化疗及造血干细胞移植的进展延长了部分AML病人的生存期,但化疗的毒副反应大,老年患者的耐受性差,缓解率低,对AML的治疗提出了挑战。AML的具体发病机制尚未完全阐明,目前研究的热点主要集中在基因的突变及其相关信号传导通路在疾病中的作用,另外有很多研究亦发现在AML的发病及进展的过程中炎症的免疫应答可能具有重要作用。炎症反应被认为是人体在遭受感染及肿瘤时的防御性反应,但长期的慢性炎症刺激却产生促癌作用,如幽门螺杆菌感染、乙型及丙型肝炎病毒感染、溃疡性结肠炎可导致胃癌、肝癌、结肠癌等等。炎症反应的致癌作用机制是复杂多面的。在炎症相关癌症中可观察到炎症组织中的基因组不稳定性。慢性炎症会使DNA修复系统受到损害,影响其相关的分子信号通路,进而增强致癌作用。在与致癌作用相关的信号通路中,NFκB和STAT3是在癌细胞中被激活的基本的途径,在肿瘤的恶性增殖中起重要作用。目前已发现的炎症小体有:NLRP1、NLRP3、NLRP6、NLRC4和AIM2炎症小体,研究最多最彻底的是NLRP3。NLRP3(NOD-like receptor pyrin domain-containing protein)炎症小体主要由NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis associated speck-like protein containing a CARD domain,ASC)和pro-Caspasel组成。微生物病原体感染等刺激使体内细胞受到损伤及死亡时,可刺激活化NLRP3炎症小体,活化Caspasel后作用于IL-1β和IL-18前体,释放其主要的效应分子IL-1β和IL-18。它们通过NF-κB(Nuclear factor-kappa B,NF-κB)、IL-6等多种下游信号分子,进一步发挥作用。NLRP3炎症小体的激活与肾脏疾病、内分泌疾病、动脉粥样硬化、炎症性肠病等疾病相关。研究显示NLRP3炎症小体相关基因的多态性与多种肿瘤相关。NLRP3(Q705K)基因多态性在健康人群中普遍存在,且被证实与恶性黑色素瘤及结肠癌等相关。IL-18(rs1946518)基因多态性与乳癌、肺癌及鼻咽癌等肿瘤的发病有关。IL-1β(rs16944)多态性与非小细胞肺癌及宫颈癌的发病有关。NFκB-94ins/del ATTG多态性与胃癌、卵巢癌、前列腺癌相关。急性白血病细胞中的NFκB的活性已被证实明显高于正常骨髓细胞。之前我们的研究发现AML患者骨髓中NLRP3和Caspase1分子的表达显著升高,而且AML患者中IL-1β和IL-18细胞因子的异常升高,显示在AML发病中存在NLRP3炎症小体的激活,进而我们推测NLRP3炎症小体相关基因的多态性可能与AML的发病及进展相关。NLRP3炎性小体的过度表达可促进肿瘤晚期的进展,在胃癌、皮肤癌、乳腺癌和肝癌等肿瘤的发病及进展的过程中起重要作用。NLRP3的表达在静息细胞中被严格调控,当收到病原体刺激或危险信号会被激活形成复合物并产生促炎细胞因子。NLRP3激活后产生IL-1β和IL-18调节免疫反应,亦可抑制NK细胞和T细胞介导的抑癌作用及免疫监视,进而促进癌症的发生及发展。目前可以激活NLRP3炎症小体的因素很多,包括ATP,毒素,K+外排,活性氧和线粒体功能障碍等。有研究显示在MDS病人的骨髓单个核细胞中NLRP3相关分子中NLRP3及Caspase1的表达亦明显高于健康人群,并且在低危及高危MDS中IL-1β、IL-18的mRNA表达亦明显高于正常人,提示在MDS中存在NLRP3炎症小体的激活。而在ALL细胞中亦有研究证实存在NLRP3及Caspasel的高表达,且此类细胞对糖皮质激素天然耐药。提示NLRP3炎症小体可能会导致白血病细胞耐药。前期我们的研究证实NLRP3信号分子基因的多态性与AML疾病的预后相关,NLRP3炎症小体的激活可能对AML细胞的生物学特性产生影响,因此我们进一步研究了 NLRP3炎症小体相关基因在AML细胞中的表达及其活化对AML细胞化疗药物敏感性影响。恶性肿瘤的易感性与精神压力相关,且在炎症刺激的条件下作用明显,有研究者认为这与中枢神经系统与免疫系统之间的联系可能有关,然而其具体机制仍有待进一步研究。精神压力及应激可导致交感肾上腺素系统激活,产生肾上腺素、多巴胺(DA)等神经递质诱导肿瘤的发生。神经递质不仅维持血流动力学稳定,还可通过细胞因子途径抑制或激活免疫系统。α肾上腺素能受体激活与单核细胞中TNFα、IL-6的增多有关,β肾上腺素受体系统激活与TNFα、IL-6、IL-1及IL-10增多有关。精神压力可通过β2肾上腺素能途径,激活cAMP/PKA通路增加肿瘤血管生成促进肿瘤细胞的生长。骨髓微环境是由血管、交感神经纤维和基质细胞等形成的复杂网络,对造血干细胞增殖、分化、更新及维持正常造血起重要作用。化疗药物损伤骨髓后,骨髓的造血微环境发生改变,交感神经系统信号减弱,影响造血干细胞的存活及增殖从而影响正常造血。骨髓微环境的改变在AML中有重要作用,突变的HSC或定向祖细胞衍生的白血病干细胞(LSCs)可在骨髓微环境中保持自我更新,成为治疗后复发的根源。在小鼠模型中,慢性应激激活p肾上腺素能信号通路促进ALL的进展。应激可能通过改变免疫细胞或骨髓微环境等作用来调控ALL的生物学特性促进ALL细胞增殖,而且应用β受体阻滞剂可阻断小鼠ALL进展。在MLL-AF9 AML模型中,去神经支配的小鼠中人白血病细胞的骨髓浸润显著增加,破坏了 SNS神经,导致成骨细胞分化表型的MSPCs扩增。表明AML在骨髓浸润部位可诱导交感神经病变,这可能反过来促进白血病进展。MLL-AF9基因突变的THP1细胞应用DR1/5特异性DA受体拮抗剂SCH39166后,扩散和集落形成能力降低,细胞周期进程的减缓,DNA新合成减少,细胞迁移率降低,提示DA可能会通过其DR1/5受体途径促进AML细胞的增殖,产生促癌作用。前期的实验表明在AML细胞中存在NLRP3炎症小体的激活,有研究显示在骨髓来源巨噬细胞中DA可抑制NLRP3炎症小体,其通过DR1途径激活cAMP,与NLRP3炎症小体结合促进其泛素化,因此我们进一步研究神经递质DA对AML细胞增殖及其NLRP3炎症小体的作用、机制及二者之间的关系。目的:1.入组383例AML病人,300例健康人为对照组,检测初诊AML病人及健康对照中 NLRP3(rs35829419)、CARD8(rs2043211)、IL-1β(rs16944)、IL-18(;rs1946518)和NFκB-94ins/del ATTG等基因的多态性及其效应分子表达,研究其是否与AML的发病及进展相关。2.AML细胞系中NLRP3炎症小体相关基因mRNA表达及药物刺激后表达的变化。3.上调及下调NLRP3基因后AML细胞系对化疗药物敏感性的改变。4.研究DA对AMLU937细胞系及NLRP3炎症小体的影响,二者之间的联系及其作用途径。方法:1.PCR检测AML病人及健康对照组骨髓或外周血中的NLRP3(rs35829419)、CARD8(rs2043211)、IL-1β(rs16944)、IL-18(rs1946518)和 NFκB-94ins/del ATTG基因的多态性。2.RT-PCR 检测 AML 病人的 IL-1β、IL-18 的 mRNA 表达。3.ELISA检测AML病人上清中IL-1β、IL-18的水平。4.RT-PCR检测Kasumi-1、NB4、K562、THP1 及 U937细胞中 NLRP3、ASC、Caspase1、IL-1β、IL-18 的 mRNA 相对表达量。LPS 作用后 IL-1β的 mRNA相对表达量。5.慢病毒干扰上调及下调NLRP3炎症小体。6.CCK8检测AML细胞加入不同浓度梯度的阿霉素、阿糖胞苷后的OD值,计算IC50值。7.CCK8检测DA、DR受体激动剂、DA+DR受体抑制剂及anti-IL-1β抗体对U937细胞增殖的影响。8.RT-PCR检测DA对U937细胞NLRP3炎症小体相关基因NLRP3、ASC、Caspasel、IL-1β、IL-18、NF-κB及凋亡增殖相关基因TP53、bax、c-myc、bcl-2的mRNA表达的影响。9.ELISA检测不同浓度DA、DR受体激动剂及DA+DR受体抑制剂作用后U937细胞上清中IL-1β水平。10.Western Blot检测DA、DR受体激动剂、DA+DR受体抑制剂及anti-IL-1β抗体对U937细胞炎症小体相关蛋白NLRP3、Cleaved Caspase1、Cleaved IL-1β及增殖相关蛋白bcl-2、c-myc的表达的影响。结果:1.NLRP3(rs35829419)、CARD8(rs2043211)、IL-1β(rs 16944)、IL-18(rs 1946518)和NFκB-94ins/del ATTG基因的多态性与AML的发病不相关。2.IL-1β(rs16944)的基因多态性在不同染色体预后分层AML病人中的分布有显著差异,染色体预后良好组GA基因型更多。3.IL-18(rs194651 8)TT基因型病人的上清IL-18的水平明显高于GG基因型。4.IL-18(rs1946518)GT基因型患者生存时间明显缩短。5.AML细胞株Kasumi-1、NB4、K562、THP1及U937 中的IL-1β、IL-18、NLRP3、Caspace-1、ASC的mRNA均有所表达,其中在THP1及U937细胞中的相对表达量较高,提示AML细胞中存在NLRP3小体的激活。6.LPS可活化AML细胞系的NLRP3炎症小体使IL-1β的mRNA表达升高,且呈剂量及时间依赖效应。7.小剂量阿霉素及阿糖胞苷可升高IL-1β的mRNA的表达,提示可能存在NLRP3炎症小体的激活。8.下调NLRP3基因表达可增加AML细胞的化疗药物敏感性,上调NLRP3基因表达可降低AML细胞的化疗药物敏感性。9.DA可促进AMLU937细胞系增殖,抗IL-1β抗体可部分抑制DA对U937细胞的增殖作用。10.DA可激活U937细胞系的炎症小体,使炎症小体相关基因的表达增多。11.U937细胞中DR5受体mRNA表达明显高于其他DR受体。DA通过DR1/5受体途径促进U937细胞增殖及激活U937细胞的NLRP3炎症小体。结论:1.IL-1β(rs16944)、IL-18(rs1946518)基因多态性可能成为AML的重要的预后因子。2.AML细胞系中存在NLRP3炎症小体激活。3.NLRP3炎症小体激活可诱导AML细胞对化疗耐药。4.DA通过DR1/5受体途径促进AML细胞系增殖。5.DA可通过其DR1/5受体途径激活U937细胞NLRP3炎症小体使IL-1β升高产生部分促癌作用,但仍存在其它的下游通路产生促癌作用。