鸭坦布苏病毒感染是自2010年6月以来发生于蛋鸭、种鸭和鹅等水禽的一种新发急性病毒性传染病,该病多发于水禽的产蛋期,以发病突然、传播迅速、采食量和产蛋量大幅度下降及卵巢出血变性为特征,已经成为危害我国水禽的主要疾病之一。坦布苏病毒是不分节段的单股正链RNA病毒,只有一个开放阅读框,编码3种结构蛋白(衣壳蛋白、膜蛋白、囊膜蛋白)和7种非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。NS1蛋白是坦布苏病毒重要的非结构蛋白,是一个高度保守的与膜功能相关的糖蛋白,其功能主要与基因组的复制和病毒粒子的组装、释放有关。除此之外,NS1蛋白包含多个保护性抗原表位,可以诱导机体产生细胞免疫和体液免疫。本研究拟筛选出与NS1蛋白互作的宿主蛋白,扩展现有的蛋白与病毒互作网络,揭示鸭坦布苏病毒NS1蛋白与宿主蛋白的作用机制,为鸭坦布苏病毒感染致病机制的阐明提供一定理论依据。本研究包括以下三个部分:一、鸭坦布苏病毒NS1蛋白互作宿主蛋白的筛选提取鸭坦布苏病毒RNA,RT-PCR扩增鸭坦布苏病毒NS1基因,双酶切NS1基因胶回收产物和空载体p GBKT7,酶切产物经连接后转化大肠杆菌DH-5α感受态细胞,筛选获得阳性克隆并增菌培养后提取质粒进行双酶切鉴定及测序分析。将空载体p GBKT7及诱饵质粒p GBKT7-NS1转化Y2H酵母感受态细胞,在SD/-Trp固体培养基培养3~5d,根据酵母的生长状况进行诱饵质粒的毒性检测;将转化诱饵质粒p GBKT7-NS1的Y2H酵母感受态细胞分别在SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-Gal/Ab A固体培养基上培养3~5d,根据酵母的生长状况进行诱饵质粒的自激活检测。将已转化诱饵质粒p GBKT7-NS1的Y2H酵母感受态细胞扩大培养后与鸭胚成纤维细胞c DNA文库杂交,经过多次筛选得到阳性文库质粒,经过测序之后对结果进行比对分析。结果,经过双酶切鉴定及测序分析,诱饵质粒p GBKT7-NS1构建成功;与转化空载体p GBKT7的酵母相比,已转化诱饵质粒p GBKT7-NS1的Y2H酵母生长良好,证明诱饵质粒p GBKT7-NS1的转入对Y2H酵母并无毒性作用;转入诱饵质粒的Y2H酵母可以在固体SD/Trp培养基上生长,在SD/-Trp/X-α-Gal/Ab A固体培养基上不能生长,证明诱饵质粒p GBKT7-NS1无自激活作用;经过酵母双杂交后,从鸭胚成纤维细胞c DNA文库中筛选出MORC3、RPS7、GABARAPL1等宿主蛋白。二、GST-Pull down试验验证NS1蛋白与宿主蛋白RPS7之间的相互作用RT-PCR扩增鸭坦布苏病毒NS1基因,双酶切NS1基因胶回收产物和空载体p GEX-6p-1,酶切产物经连接后转化大肠杆菌DH-5α感受态细胞,筛选获得阳性克隆并增菌培养后提取质粒进行双酶切鉴定及测序分析。将阳性质粒p GEX-6p-1-NS1转化入E.coli BL21(DE3)感受态细胞,扩大培养后利用IPTG诱导使其表达,裂解菌体后离心获得融合蛋白,通过WB试验进行验证。从培养的鸭胚成纤维细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增RPS7基因,双酶切RPS7基因胶回收产物和空载体p EGFP,酶切产物经连接后转化大肠杆菌DH-5α感受态细胞,筛选获得阳性克隆并增菌培养后提取无内毒素质粒进行双酶切鉴定并测序。将无内毒素阳性质粒p EGFP-RPS7转染293T细胞,待RPS7蛋白表达后收取细胞,通过WB试验进行验证。最后通过GST-Pull down试验来验证GST-NS1蛋白与GFP-RPS7蛋白之间是否有相互作用。结果表明,双酶切试验和测序分析显示成功构建重组质粒p GEX-6p-1-NS1和p EGFP-RPS7;通过WB试验利用GST标签一抗分析GST-NS1蛋白的表达,结果显示获得了大小约为70KD的GST-NS1融合蛋白;通过WB试验利用GFP标签一抗分析GFP-RPS7蛋白的表达,结果显示获得了大小约为50KD的GFP-RPS7融合蛋白;通过WB试验利用GFP标签一抗分析GST-Pull down试验中的猎物流穿液和诱饵-猎物流穿液,得到了大小分别为50KD和120KD的特异性条带,证明鸭坦布苏病毒NS1蛋白和鸭RPS7蛋白之间确实存在相互作用。三、荧光定量分析RPS7蛋白相关信号通路将pEGFP空质粒和重组质粒p EGFP-NS1分别转染293T细胞,待NS1蛋白表达后收取细胞,以Trizol法提取细胞总RNA。参考相关文献,设计有关RPS7蛋白的MDM2、P53信号通路的荧光定量引物,以转染后的细胞总RNA为模板进行荧光定量检测。结果表明,与转入空质粒的细胞相比,RPS7的m RNA的表达量降低了31.06%,MDM2的m RNA表达量降低了36.71%,但是P53的m RNA表达量升高了79.80%(P<0.05)。这表明,NS1蛋白的表达能够下调RPS7和MDM2的转录水平,进而导致了P53 m RNA的表达水平升高,这有可能引起相应蛋白表达水平升高,最终导致细胞凋亡的发生。