胰蛋白酶是一种由胰腺分泌的丝氨酸蛋白酶,广泛应用于科学研究、食品加工、医药制造等行业,需求量很大,且逐年增加。胰蛋白酶在应用过程中,不仅会水解底物蛋白,也会通过“自切”快速降解自身蛋白分子,引起酶活力的迅速下降,从而制约了胰蛋白酶的水解效率和应用水平。另外,胰蛋白酶制剂主要通过动物胰脏进行提取,具有原料受限、成本高、纯度低的缺点,如果能通过微生物表达生产胰蛋白酶,将大大降低生产成本。本研究以猪源胰蛋白酶为对象,通过基因工程技术实现胰蛋白酶的微生物异源表达,研究通过生物质谱技术解析其自切过程和规律,并通过化学修饰提高胰蛋白酶的抗自切能力。具体研究工作如下:首先,通过毕赤酵母表达胰蛋白酶酶原,构建重组表达载体pPIC9K-try,将其转化到毕赤酵母(P.pastoris)GS115中,筛选出阳性转化子后进行甲醇诱导发酵,结果发现:发酵液上清的SDS-PAGE凝胶电泳图中,相比对照存在分子量大小符合的对应条带,并且经肠激酶激活之后检测到了胰蛋白酶酶活力,说明猪胰蛋白酶原基因try在毕赤酵母中成功得到了表达。其次,分别通过MALDI-TOF-MS和LC-Q-TOF技术解析了胰蛋白酶的赖氨酸和精氨酸自切位点及其动态变化,明确了对自切影响比较大的氨基酸位点为Lys-77、Arg-57 以及 Lys-97。最后,尝试通过甲基化修饰方法提高胰蛋白酶的抗自切性能,发现甲基化修饰对胰蛋白酶抗自切性能改善的同时伴随着酶活力的一定损失。在此基础上,分别考察了蛋白浓度、甲基化试剂添加量和反应时间对甲基化效果的影响,发现胰蛋白酶浓度10 mg/ml,甲基化试剂添加量30μl,反应时间3 h条件下,所获甲基化酶的酶活收率和6小时酶活保留率分别达了 78%和79%,即在酶活损失22%的情况下,6小时酶活保留率相比对照提高了约18%。本研究的发现,有助于加强对胰蛋白酶自切规律的认识和提高其抗自切能力,同时其微生物异源表达的进展,也为将来通过微生物发酵实现胰蛋白酶的大量生产建立了重要的基础。