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羊泰勒虫病(Ovine Theileriosis)是由寄生在绵羊和山羊红细胞、淋巴细胞或巨噬细胞内的泰勒科(Theileriidae)泰勒属(Theileria)的血液寄生原虫引起的一类疾病的总称;无浆体病(Anaplasmosis)是由无浆体科(Anaplasmataceae)无浆体(Anaplasma)属病原寄生于人和动物血细胞内引起的蜱传性血液立克次体病。羊泰勒虫病和无浆体病均属于蜱传性疾病,引起人和动物极为类似的高热、贫血、黄疸和消瘦等临床症状,严重感染时可导致死亡。吕氏泰勒虫(T.luwenshuni)是一种恶性羊泰勒虫,具有很强的致病性;嗜吞噬细胞无浆体(A.phagocytophilum,AP)作为一种人兽共患病病原,严重威胁着人和动物的健康,临床常见两种病原混合感染。目前,针对这两种病原的检测主要是常规PCR方法,但一次仅限于一种特定病原的检查,而在临床应用中耗费人力物力。迄今为止,关于同时检测T.luwenshuni和AP的PCR诊断方法,未见报道。本研究旨在建立一种特异性强、灵敏度高、重复性好的双重PCR检测方法,以期能够同时检测T.luwenshuni和AP,为两种病原快速检测及其所致疫病的快速诊断提供技术方法。1.吕氏泰勒虫PCR方法的建立及应用为建立灵敏度高、特异性强的羊吕氏泰勒虫检测方法,本研究根据Gen Bank上发表的T.luwenshuni(登录号:KC735166.1)18S r RNA基因序列设计引物T.lu7F/T.lu7R,建立PCR检测方法。优化该方法的最佳反应体系和反应条件,并进行特异性、敏感性、重复性试验及临床样品检测。结果表明,所建立的羊吕氏泰勒虫PCR检测方法能特异性扩增出962bp目的片段,而与尤氏泰勒虫(T.uilenbergi)、绵羊泰勒虫(T.ovis)、环形泰勒虫(T.annulata)、莫氏巴贝斯虫(Babesia motasi)和刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)均无交叉反应;T.luwenshuni DNA最大稀释倍数为10-7,即DNA最低检测量为29.13 fg·μL-1;且重复性好;应用所建PCR方法和报道的PCR方法分别对76份羊临床血液样品检测,结果显示该方法T.luwenshuni阳性检出率为77.63%(59/76),高于已报道PCR方法的阳性检出率(60.53%,46/76),检出率差异具有统计学意义(0.01<p<0.05)。结果表明本研究建立的吕氏泰勒虫PCR方法可用于临床样品检测。2.吕氏泰勒虫和嗜吞噬细胞无浆体双重PCR方法的建立及应用应用上述特异性扩增T.luwenshuni 18S r RNA基因的引物,并结合已报道特异性扩增AP16S r RNA基因的引物,通过优化该方法的最佳反应体系和反应条件,并进行特异性、敏感性、重复性试验及临床样品检测,建立了能同时检测T.luwenshuni和AP的双重PCR方法。结果表明,该方法能特异性扩增出大小为962 bp(T.luwenshuni)和641 bp(AP)的目的片段,与T.uilenbergi、T.annulata、T.ovis、绵羊无浆体(A.ovis)、牛无浆体(A.bovis)、边缘无浆体(A.marginale)、B.motasi和T.gondii均无交叉反应;T.luwenshuni和AP DNA的最低检测量分别为29.13 fg·μL-1、1.53 fg·μL-1;重复性好;利用单PCR和双重PCR方法分别对54份羊临床血液样品进行检测,结果表明单PCR检测T.luwenshuni和AP的阳性率分别为87.04%(47/54)、83.33%(45/54),混合感染率为72.22%(39/54);双重PCR检测T.luwenshuni和AP的阳性率分别为87.04%(47/54)、68.52%(37/54),混合感染率为55.56%(30/54);单PCR与双重PCR检测T.luwenshuni的敏感性相同,双重PCR检测AP的敏感性低于单PCR,但所建方法能够用于羊T.luwenshuni和AP临床样品的检测,为这两种病原检测提供了新的技术方法,对其早期诊断和流行病学调查具有重要意义。