研究背景及目的:对于许多实体器官终末期疾病及肿瘤、血液疾病来说,器官移植或者造血干细胞移植已成为一种重要的治疗手段。随着免疫抑制剂的发明和广泛应用,大部分移植排斥反应得到了有效控制,移植物的长期存活率得到了明显提升。但仍有相当一部分移植排斥反应控制效果不佳,导致移植物功能障碍或衰竭,严重者甚至导致二次移植或者宿主死亡。因此,关于移植排斥反应的研究仍在如火如荼的进行中。急性移植排斥反应是同种异体器官移植中最常见的一类排斥反应,一般多于移植术后数天至两周左右出现,80-90%发生于术后一个月内,也有相当一部分受者在移植术后相当长一段时间内反复发作。而T细胞免疫应答在移植排斥反应中发挥重要作用乃是全世界公认的事实。其中,在急性移植排斥反应中,CD4+T细胞介导的迟发型超敏反应是主要的损伤机制。T细胞可通过直接识别和间接识别对同种异型抗原进行识别。移植物中的过客白细胞(passenger leukocytes,主要为成熟的DC和巨噬细胞等APC)可进入受体的血液循环及淋巴组织,在外周淋巴组织与外周淋巴器官中(主要是淋巴结和脾脏)与受体的T细胞接触后可通过直接识别(direct recognition)将同种移植抗原直接递呈给受体T细胞,以快速活化T淋巴细胞;或通过间接识别(indirect recognition)的方式将同种MHC抗原提呈给受体T细胞,介导T细胞活化的免疫应答过程,产生机体针对移植物的移植排斥反应。器官移植后的免疫应答过程复杂,不同的免疫细胞及其亚群的活化、细胞与细胞的相互作用及其信号调控、分泌的细胞因子以及神经-内分泌均在移植排斥反应的产生中发挥调控作用,包括(1)细胞与细胞之间的相互作用。调节性T细胞是近年来认识的发挥重要调控作用的细胞。研究表明,CD4+CD25+Treg可通过细胞直接接触(包括CTLA-4、PDL-1等分子结合)的方式,调控T细胞的增殖,并可下调共刺激分子,抑制T细胞活化。(2)细胞因子对细胞的调控。调节性T细胞大体上可分为CD4+CD25+Tr细胞、Tr1细胞、Th3细胞等亚型。CD4+Th2细胞活化后可分泌IL-10,诱导Tr1细胞生成,Tr1细胞活化后也可分泌IL-10。而Th3细胞分泌TGF-β,则对CD4+Th1、Th2都有抑制作用。(3)神经内分泌调节T细胞的分化。有研究表明,GH缺陷时CD4+CD8+双阳性胸腺细胞减少,GH还影响胸腺细胞的迁移和释放。体外注射T3则能增加CD44+胸腺细胞的数量。生长激素促分泌素受体(growth hormone secretagogue receptor,GHSR),也是胃饥饿素的受体,首先是作为生长激素促分泌素(growth hormone secretagogue,GHS)的靶受体被发现,随即在人类脑垂体和下丘脑中发现其存在。Zigman JM等发现GHSR在中枢和外周组织中均有广泛表达。GHSR的生理功能包括:(1)与多种激素的释放有关,如生长激素,促肾上腺皮质激素,皮质醇,催乳素;(2)调节食物摄入和能量代谢;(3)影响血糖和血脂代谢;(4)调节胃肠运动和分泌和胰腺功能;(5)调节细胞增殖和存活;(6)在衰减促炎症级联反应和调节老化和胃肠道内稳态的调节中发挥重要的免疫功能作用;(7)保护神经和心血管系统。但是,GHSR是否在移植排斥的产生和调控过程中发挥重要的作用,目前尚未有相关研究的报道。基于此,本研究在通过构建GHSR缺陷小鼠,研究GHSR在不同免疫细胞中的表达,探讨GHSR对免疫细胞增殖的影响。在建立小鼠心脏同种异体异位移植模型的基础上,研究GHSR在急性移植排斥中的作用及体内细胞与分子机制。为GHSR阐述GHSR在同种移植排斥的作用、更有效的防治移植排斥反应提供实验数据。第一部分:小鼠颈部心脏同种异体移植模型的建立及GHSR在急性移植排斥反应中的作用目的:建立小鼠颈部心脏同种异体移植后急性排斥反应模型并研究GHSR在急性移植排斥反应中的作用。方法:1)、选取6周龄的体重、性别相匹配的Balb/c小鼠作为供体,8周龄的体重、性别相匹配的GHSR-/-(实验组)和C57BL/6(对照组)小鼠作为受体,行颈部异位心脏移植术。2)、观察其移植物生存期。3)、术后第5天取移植物行病理检查(HE染色)。4)、用RT-PCR检测术后移植物中炎症因子IL-1、6、17、TNF-a的m RNA表达的变化。5)、流式细胞术检测术后受体小鼠脾脏、淋巴结中T细胞亚群的变化。结果:GHSR缺陷可明显延长移植物生存期;HE染色显示实验组小鼠心肌细胞水肿、坏死、炎症细胞浸润等较对照组明显减轻;实验组小鼠移植后移植物各炎症因子的表达均低于对照组;其脾脏及淋巴结内的CD4+T细胞比例也低于较对照组,Treg细胞比例均高于对照组。结论:GHSR缺陷后可减轻急性移植排斥反应,对移植物发挥保护作用。第二部分:GHSR在同种器官移植急性排斥反应中的细胞分子机制研究目的:研究GHSR在急性移植排斥反应中的作用机制。方法:1)、免疫组化分析移植物中浸润的细胞种类。2)、RT-PCR检测移植物中细胞表面分子m RNA的表达;3)、混合淋巴细胞反应检测两组小鼠T细胞增值能力的变化。4)、Western-blot检测T细胞激活通路中NF-κB通路中关键蛋白的变化。5)、Western-blot检测NF-AT、AP-1、Foxp3蛋白的变化。结果:免疫组化显示移植物的浸润细胞以T细胞为主,但GHSR缺陷的小鼠的T细胞数量明显低于对照组;GHSR缺陷小鼠的T细胞增值能力较C57BL/6小鼠减弱;实验组小鼠移植后NF-κB通路中ZAP-70、IKKβ、p65蛋白活化均低于对照组;在GHSR缺陷的小鼠中,由于NF-AT和AP-1表达增加,上调了Foxp3的表达,使Treg比例增加。结论:GHSR可通过影响T细胞增殖、分化、活化等功能在移植排斥反应中发挥重要作用。