论文部分内容阅读
目的缺血性卒中有着极高的发病率、致残率和死亡率,严重危害人类健康和生命安全,与之相关的神经康复问题一直是人们关注的热点和难点。由于大量轴突生长抑制因子的存在,中枢神经系统(CNS)损伤后神经元再生极为困难。然而在某些干预因素作用下,遭遇机械性损伤或缺血缺氧损害的神经元轴突可以再生,并促进原受损轴突支配区的功能恢复[1, 2]。RGMa(repulsive guidance molecule a)是一种轴突导向分子,同时也是迄今已知的轴突再生抑制因子中最有潜力的一种。研究发现,在大鼠脊髓损伤后给予特异性抗体中和RGMa表达,可显著改善损伤轴突生长情况并有效促进神经功能恢复[3]。本课题运用重组腺病毒rAd5-shRNA-RGMa对大脑中动脉阻塞(MCAO)/再灌注大鼠缺血区域皮质和海马进行RNA干扰,观察该特异性干预手段对急性局灶性缺血再灌注损伤大鼠脑皮质及海马中RGMa表达水平、轴突生长/再生情况以及神经功能恢复的影响,进一步阐明RGMa在CNS轴突再生抑制因子中的重要地位,为临床脑缺血治疗寻找有效靶点进行基因干预以促进神经功能恢复提供依据并奠定基础。方法1.通过HEK 293细胞扩增得到大量重组腺病毒液并进行纯化,用50%组织培养感染剂量(TCID50)法测定滴度;再将三种不同滴度重组腺病毒rAd5-shRNA-RGMa及病毒保存液PBS(阴性对照)注射至线栓法MCAO/再灌注大鼠(n=32)缺血部位脑皮质和海马区,观察转染局部病理改变和炎症因子表达情况,评估毒性反应强弱,并计算转染效率,确定用于转染缺血脑组织的最佳滴度;2.健康成年雄性SD大鼠66只,随机分为正常组,假手术2 d、7 d组,MCAO/再灌注模型2 d、7 d组,空白对照(PBS)2 d、7 d组,阴性对照(rAd5-HK)2 d、7 d组,RNAi干预(rAd5-shRNA-RGMa)2 d、7 d组共11组。分别取材用于RT-PCR和免疫组化检测缺血侧脑皮质和海马区RGMa mRNA和蛋白表达水平及轴突生长情况。3. SD大鼠(n=42)随机分为正常组、模型组、阴性对照组和RNAi干预组,进行TTC染色和生物素葡聚糖胺(BDA)轴突示踪,观察脑梗死范围和轴突侧枝芽生数量,并通过行为学检查评估大鼠神经功能恢复情况。结果1.纯化后的重组腺病毒滴度分别为:rAd5-shRNA-RGMa为5.01×1010 pfu/ml,rAd5-HK为3.16×1010 pfu/ml。三种不同滴度的重组腺病毒rAd5-shRNA-RGMa均可转染大鼠缺血部位脑皮质和海马,中、高滴度组的转染效率显著优于低滴度组(p<0.01),但该两组之间并无差异(p>0.05)。仅高滴度组大鼠腺病毒注射局部脑组织有血管周围炎性细胞浸润现象,且术后7 d该组大鼠脑组织炎症因子IL-1β的表达水平明显高于其他各组(p<0.01)。2.与正常组和假手术组相比,其余各组大鼠缺血侧脑皮质和海马区的RGMa mRNA和蛋白水平均增高(p<0.01),MCAO/再灌注2 d、7 d组,空白对照2 d、7 d组和阴性对照2 d、7 d组尤为明显,同时伴有轴突形态紊乱、数目减少;而给予RGMa特异性RNAi干预后,缺血侧脑皮质和海马区RGMa mRNA和蛋白表达水平有所下调,轴突生长情况有所改善(p<0.01)。3.和MCAO/再灌注组和阴性对照组相比,给予RGMa特异性RNAi干预的大鼠脑梗死体积没有显著差别(p>0.05),但在治疗6 w后行为学评分明显增高(p<0.01),健侧皮质红核束向病灶侧发出的侧枝数量亦明显增多(p<0.01)。结论纯化后的重组腺病毒rAd5-shRNA-RGMa可稳定、低毒、高效地转染大鼠缺血脑组织,是用于缺血性脑损伤基因治疗研究的有利工具。大鼠脑皮质和海马区RGMa的mRNA和蛋白在急性局灶性脑缺血/再灌注后表达持续增高,给予RGMa特异性RNAi后可显著降低其表达水平,从而改善轴突生长情况,促进大鼠运动功能的康复。其途径可能是RGMa表达的降低促进了健侧皮质神经元轴突的芽生,大量延伸至病灶侧代偿其原有功能。