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小鹅瘟是由鹅细小病毒(GPV)引起的雏鹅的烈性传染病,其传染性强,致死率高,病程短且死亡率极高,对养鹅业危害严重。1956年,方定一等在扬州首先发现本病,并于1961年用鹅胚分离到本病病原,随后国内外学者对小鹅瘟进行了大量研究并取得一定进展。对鹅细小病毒的实验室诊断,许多学者曾先后报道了不同方法,其准确灵敏的有效诊断手段直接影响着养鹅业的发展。鹅细小病毒为细小病毒科、细小病毒属成员,该病毒基因组为单股线性DNA, GenBank发表的鹅细小病毒B株核苷酸序列长5106bp,有三种结构蛋白,其中,VP3结构蛋白是GPV的主要衣壳蛋白,VP3含有GPV主要抗原决定簇成分,是GPV的主要免疫保护性抗原,能诱导机体产生中和性抗体,因此VP3基因编码的VP3蛋白在小鹅瘟免疫防治和诊断中起重要作用,是研究基因工程疫苗的首选蛋白。本研究基于VP3的体外表达和其单克隆抗体的研制,致力于完善GPV感染的诊断技术,建立了双抗体夹心ELISA方法,并分析所得单克隆抗体的抗原表位区,为建立以表位为基础的抗原抗体检测方法奠定了基础。1.鹅细小病毒VP3基因在大肠杆菌中的优化表达本研究根据GenBank发表的鹅细小病毒B株全基因序列,针对VP3基因设计一对特异性引物,利用PCR技术扩增VP3基因,并将PCR产物按预定的阅读框插入到原核表达载体pCold-TF中,获得重组质粒pCold-TF-VP3,大小为1605bp,与预期结果一致。将重组质粒pCold-TF-VP3转化大肠杆菌E. coli BL21(DE3)获得高效诱导表达,通过菌体裂解上清液进行SDS-PAGE分析,该重组菌可表达大小为106kDa的可溶性融合蛋白,经免疫印迹分析该重组蛋白能被鼠抗GPV阳性血清特异识别,说明体外表达的融合蛋白有较好的反应原性。2.抗GPV单克隆抗体的制备及初步应用采用PEG浓缩病毒,蔗糖梯度离心纯化得到的鹅细小病毒液作为制备单克隆抗体的免疫原,免疫6周龄BALB/c雌性小鼠,4次免疫后制备免疫小鼠脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA(以纯化的病毒液和pCOLD-TF-VP3蛋白为筛选抗原)筛选出9株能分泌抗GPV的单克隆抗体,采用有限稀释法进行三次亚克隆,最终获得3株能稳定分泌抗鹅细小病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1C4、1C6、3E8,单抗腹水的ELISA效价分别为1：128000、1：256000、1：64000。免疫印迹结果表明此单抗能与纯化的鹅细小病毒发生特异性反应,而与DHV、DPV、NDV无交义反应。由于单克隆抗体的高特异性及生物索-亲和素系统(BAS)的灵敏性和稳定性,将纯化的3E8进行生物素标记并测得标记效价为1：256000,然后简历检测GPV的双抗体火心ELISA方法,以单克隆抗体1C4为捕获抗体,以生物素(biotin)标记的3E8株单克隆抗体为第二抗体,方阵检测确定捕获抗体的最佳浓度为2μg/mL, Biotin-3E8的最佳工作浓度为50ng/mL,GPV最低检出量为88ng/mL。用建立的双抗体夹心法检测15份有病变的组织病料,8份为阳性,和PCR扩增结果符合率为86.6%,说明了建立的BAS-ELISA可用于GPV感染的临床诊断。3.抗GPV单克隆抗体的抗原表位分析本研究根据GenBank发表的鹅细小病毒B株全基因序列,将采用分段PCR方法扩增GPV VP3基因,共分为4个片段,分别命名为A、B、C、D,其对应的氨基酸位点分别位(?)1～152aa、135～332aa、323～535aa、1～535aa,并分别克隆到真核表达载体pCAGGS,成功构建了真核表达重组质粒；通过脂质体法将筛选到的四个阳性重组质粒质粒pCAGGS-A、pCAGGS-B、pCAGGS-C、pCAGGS-D分别转染COS-1细胞,用简洁免疫荧光进行检测。结果显示,在VP3基因的135-332aa和322-535aa处用间接免疫荧光检测可看到在COS-1细胞表面可见特异性荧光,进一步证明了单克隆抗体的特意性,并初步确定3E8株单抗的抗原表位在322～332aa上