研究背景非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)作为肺癌中最常见的一种病理类型,因其起病隐匿,很多患者在初次明确诊断时已发生远处转移,故化疗成为其主要的治疗方式。顺铂作为经典的非小细胞肺癌一线化疗药物,在临床治疗中能够有效地减轻患者的肿瘤负荷,改善患者的生活质量,以及延长患者的生命。然而,临床上可见部分患者刚开始对顺铂治疗敏感,而后逐渐出现耐药现象。为了解决此问题,医生不得不增加化疗药物剂量,进而导致更加严重的毒副作用,极大地损害了患者的生活质量和临床预后。因而,探索顺铂耐药的分子生物学机制,对于深入理解肿瘤患者化疗耐受的根本原因以及实现非小细胞肺癌患者的个体化治疗有着重要的意义。之前的一些研究显示,肿瘤细胞能够在细胞膜表面过表达一些膜转运蛋白,这些蛋白可以主动地将一些化疗药物从细胞内泵出,通过降低肿瘤细胞内化疗药物的浓度,进而导致肿瘤细胞耐药的产生。ABCG2作为一种重要的膜转运蛋白,广泛分布于具有分泌功能的正常组织器官及多种肿瘤细胞上,可通过ATP水解释放的能量主动泵出细胞内的各种化疗药物。同样地,ABCG2在非小细胞肺癌耐药模型中存在着过表达,且有研究显示ABCG2阳性的非小细胞肺癌患者相对于ABCG2阴性的患者,有着更低的化疗有效率和更短的总体生存率。然而,ABCG2可能还存在一些新的作用有待我们进一步探索。最新研究显示ABCG2可能在促进肿瘤细胞快速增殖上起着一定作用,抑制ABCG2的表达,可以显著降低肿瘤细胞的增殖。同时,有研究表明ABCG2可以作为一个调节细胞由对称分裂向非对称分裂相互转换的开关,能够直接调控心脏侧群细胞的胞分裂方式,决定细胞的分化命运。在正常情况下,细胞主要以非对称分裂为主,以维持细胞数量的恒定和组织的正常功能;当组织受到损伤后,细胞的分裂模式会发生变化,由非对称分裂转变为对称分裂,进而使细胞在短时间内快速增殖以促进组织修复。在临床上,由于化疗的毒副作用,患者在完成一个阶段化疗后,往往需要间隔三周左右的时间来恢复造血功能以及由化疗导致的正常组织损伤。然而,我们发现部分患者的肿瘤会在这三周化疗间期内复发及快速生长,甚至可以恢复到化疗前肿瘤的大小。结合以上的文献报道,我们推测肿瘤经受化疗打击类似于组织受到损伤,“幸存的”化疗耐药的肿瘤细胞的分裂模式极有可能发生改变,由非对称分裂转变为对称分裂,进而促使耐药的肿瘤细胞数量在短期内快速增长,最终导致肿瘤的复发。由于复发肿瘤细胞主要以对称分裂为主,增殖能力加强,使得复发肿瘤具有一定耐药性,再次使用化疗药物亦不能缩小肿块,从而导致化疗失败。综上所述,我们认为abcg2不仅可以作为一种重要的多药耐药蛋白介导化疗耐受,还有可能通过促进肿瘤耐药细胞以对称分裂的方式快速增殖来对抗化疗药物的打击。为了证实我们的假说,本研究拟采用顺铂体外周期性诱导培养的方式,从肺癌h460细胞和a549细胞中建立稳定的耐药细胞系。然后通过real-timepcr和western-blot检测耐药的非小细胞肺癌细胞中是否存在abcg2的高表达,同时我们将运用pkh26染料标记观察单个细胞的分裂模式,观察亲代细胞和耐药细胞是否存在分裂模式差异。为了进一步明确abcg2对耐药细胞分裂模式的影响,我们将通过rnai干扰技术以及基因过表达技术建立稳定的abcg2沉默和过表达细胞系,观察abcg2对耐药小细胞肺癌分裂模式的影响。本研究的成功实施,将会进一步加深目前对abcg2在非小细胞肺癌耐药中的认识,为防治肺癌耐药和复发提供相应的一些理论基础。研究方法1.非小细胞肺癌顺铂耐药细胞系的建立及鉴定首先采用mtt法检测顺铂对亲代a549细胞及h460细胞的半数抑制浓度(ic50),然后采用ic50浓度的顺铂连续体外诱导培养亲代a549细胞和h460细胞3天,耐药后存活细胞于普通培养基中恢复3天,如此反复诱导6个月。收集耐药细胞鉴定其耐药性,主要是通过mtt法检测耐药细胞株较亲代细胞株的ic50值是否成倍增加来明确。2.非小细胞肺癌顺铂耐药细胞中abcg2的表达及分裂模式研究通过real-timepcr和western-blot检测亲代a549、h460细胞及耐药细胞a549/cisr、h460/cisr中abcg2mrna和蛋白的转录及表达情况,观察耐药细胞中是否存在着abcg2的过表达。采用sigma公司pkh-26荧光细胞标记试剂盒明确亲代细胞与耐药细胞的分裂模式差异。3.建立稳定的abcg2过表达组及沉默组运用慢病毒转染亲代a549细胞的方式建立稳定的abcg2过表达组a549/abcg2与对照组a549/gfp;同时运用rnai技术沉默a549/cisr中abcg2基因的表达,建立稳定的abcg2沉默组a549/cisrshabcg2与对照组a549/cisrshgfp。然后通过real-timepcr和western-blot分别检测a549/abcg2、a549/gfp、a549/cisrshabcg2、a549/cisrshgfp中abcg2mrna和蛋白的转录及表达情况。4.abcg2对顺铂耐药的非小细胞肺癌细胞分裂模式的影响运用pkh-26染料标记单个细胞分裂模式的方式,分别观察a549、a549/abcg2、a549/gfp、a54/cisr、a549/cisrshabcg2、a549/cisrshgfp各组细胞的细胞分裂模式,从而明确abcg2对顺铂耐药的非小细胞肺癌细胞分裂模式的影响。研究结果1.顺铂体外连续诱导培养a549亲代细胞和h460亲代细胞,从而建立稳定的顺铂耐药的a549/cisr细胞和h460/cisr细胞。运用mtt法分别检测顺铂对耐药前后非小细胞肺癌细胞的半数抑制浓度(ic50),检测结果提示:a549细胞和a549/cisr细胞的ic50值分别为6.14μm和43.01μm,h460细胞和h460/cisr细胞的ic50值分别为4.01μm和29.19μm。a549/cisr细胞的耐药性增加到7.01倍,而h460/cisr细胞耐药性增加到7.28倍,耐药细胞的ic50值较亲代细胞的ic50值均成倍增加,说明我们成功建立了顺铂耐药的a549/cisr细胞和h460/cisr细胞。2.通过real-timepcr和western-blot分别检测亲代细胞与耐药细胞中abcg2的表达情况,结果显示:耐药a549/cisr细胞和h460/cisr细胞较亲代a549细胞和h460细胞abcg2mrna转录水平和蛋白表达水平明显升高。同时运用pkh-26染料分别标记各组亲代细胞和耐药细胞,研究结果显示:a549细胞中73.9%的细胞采取非对称分裂的方式,16.7%以非对称分裂的方式为主。在h460细胞中82.2%的细胞采取不对称分裂的方式,9.5%以对称分裂方式为主。在顺铂耐药的a549/cisr细胞中,77.2%的细胞倾向于以对称分裂为主,10.1%的细胞采取非对称分裂的方式。在顺铂耐药的h460/cisr细胞中73.9%的细胞采取对称分裂的模式,13.3%的细胞以非对称分裂的方式。综合以上结果可知,a549和h460亲代细胞主要以非对称分裂为主,而耐药细胞倾向于以对称分裂为主。3.为了明确abcg2对顺铂耐药的非小细胞肺癌细胞分裂模式的影响,我们通过慢病毒转染a549细胞建立abcg2过表达的细胞系a549/abcg2。接下来通过real-timepcr和western-blot技术检测检测了a549/abcg2细胞中abcg2的mrna和蛋白表达水平。结果显示a549/abcg2细胞中abcg2明显过表达。随后pkh26染色结果显示,在a549/abcg2细胞中对称分裂的比例为81.7%,要明显高于亲代a549细胞的16.7%。以上结果表明过表达abcg2可以增加亲代a549细胞对称分裂的比例。4.为了进一步明确ABCG2对顺铂耐药的非小细胞肺癌细胞分裂模式的影响,我们通过RNAi干扰A549/CisR建立ABCG2沉默细胞系A549/CisRshABCG2。接下来通过Real-time PCR和Western-Blot技术检测检测了A549/CisRshABCG2细胞中ABCG2的mRNA和蛋白表达水平。结果显示A549/CisRshABCG2细胞中ABCG2表达明显受到抑制。随后PKH26染色结果显示,在A549/CisRshABCG2细胞中对称分裂的比例为11.1%,要明显低于耐药A549/CisR细胞的77.2%。以上结果表明降低ABCG2的表达可以降低耐药A549/CisR细胞对称分裂的比例。结合之前ABCG2过表达细胞分裂模式的结果,本研究初步表明ABCG2可以调节顺铂耐药的非小细胞肺癌细胞分裂模式。结论1.本研究通过体外顺铂连续诱导的方式建立了稳定的顺铂耐药的非小细胞肺癌细胞系,耐药后细胞的IC50值较亲代细胞的IC50值成倍增加,为研究耐药机制提供了很好的细胞模型。2.本研究证实,与亲代A549细胞和H460细胞相比,顺铂耐药的A549/CisR细胞和H460/CisR细胞存在着ABCG2的过表达。通过PKH26染色发现亲代细胞和耐药细胞间细胞分裂模式存在着明显差异:耐药A549/CisR细胞和H460/CisR细胞以对称分裂模式为主,亲代A549细胞和H460细胞以非对称分裂为主。3.ABCG2可以调节顺铂耐药的非小细胞肺癌细胞分裂模式。通过慢病毒转染A549细胞建立ABCG2过表达的细胞系后,其分裂方式由非对称分裂为主转变为对称分裂为主;通过RNAi干扰耐药A549/CisR细胞建立ABCG2沉默细胞系后,其分裂方式由对称分裂为主转变为非对称分裂为主。