非寄主抗性是(NHR)一种植物的所有基因型对一种病原微生物的所有基因型都表现抗性。非寄主抗性涉及植物叶面或表皮细胞提供的预成型物理或化学壁垒,这些预成型保护机制不仅可以阻止侵染结构的建立,而且能够诱导物理或化学抗性(Heath 2000; Mysore and Ryu 2004)。非寄主抗性是最普遍的植物抗性,具有高效持久的特点,研究非寄主抗性可以更好地理解植物一般抗性和广谱抗性的分子机理,因此其在农作物的品种改良上有重要的应用价值.虽然大多数的谷物至少感染一种锈菌,然而,水稻对所有已知的锈菌免疫。水稻对锈菌的这种免疫被称为非寄主抗性。把水稻的这种非寄主抗性转移至小麦或开发转移这种抗性到其它农作物上的可能是一个诱人的提议。因此,本研究主要选用非寄主植物水稻品种日本晴、寄主植物小麦和和小麦叶锈菌作为研究对象,利用组织学、转录组学(运用cDNA Microarray即微阵列技术)、蛋白质组学(双向电泳结合质谱鉴定)来分别研究水稻品种日本晴对非寄主病原小麦叶锈菌的非寄主抗性。同时,本研究以小麦品种水源11分别与条锈菌条中CY31和CY23构成的亲和与非亲和组合为材料,采用蛋白质组学技术对其进行表达谱分析,分离差异表达的蛋白质,质谱鉴定并通过生物信息学分析蛋白基因的基本特性;利用qRT-PCR技术验证差异表达蛋白基因的表达特征;得到了如下的研究结果1.利用组织化学染色和细胞学方法观察了非寄主病原小麦叶锈菌在水稻品种日本晴叶面的发展过程,揭示出叶锈菌从入侵到发育最终受阻过程中一系列细胞学事件的发生顺序,明确了水稻抗锈性表达以及非寄主细胞防卫反应的细胞学特征。接种后1天,在水稻叶面上,只有大约10%萌发产生芽管的夏孢子能够定位气孔并在气孔上产生附着胞,接种后3天,水稻叶面上靠近附着胞的细胞积累过氧化氢。接种后7天,大约3%的附着胞在叶片内产生短的菌丝,这伴随着由于菌丝侵袭而引发的邻近细胞的荧光。仅约0.2%的穿透菌丝继续在叶肉细胞间萌发。在接种后22天,极少量的侵染菌丝生长横跨几个叶肉细胞形成侵染菌丝,然而,没有观察到吸器母细胞和吸器。靠近菌丝的叶肉组织细胞看起来有些收缩。接种后45天,叶锈菌的侵染激发侵染点(附着胞)周围的胼胝质和酚类物质的沉积。在侵染点周围观察到片段化的菌丝。在叶肉组织中定殖表明叶锈菌能够从叶面获取营养,然而,至始至终没有观察到坏死斑和孢子堆。胼胝质和酚类物质的沉积说明预成型防卫机制在水稻对叶锈菌的非寄主抗性中起很大作用。2.利用基因组学方法,使用水稻全基因组微阵列芯片(Microarray)检测了水稻品种日本晴在接种非寄主病原小麦叶锈菌24h后,相比于对照,转录组的变化。微阵列分析显示非寄主病原叶锈菌激活了寄主的转录反应,一套上调或下调的对非寄主企图侵染反应的基因被鉴定。尤其是,相比与对照,由五个探针组Os.55776.1.S1_x_at,Os.55647.1.A1_at, Os.55776.1.S1_at, OsAffx.10944.1.S1_x_at和OsAffx.10944.1.S1_at代表的两个位点对叶锈菌的企图侵染表现出高度诱导。这两个位点至少代表了第一染色体上一个受体相似型激酶(RLK)基因簇上的一员。位于这个激酶基因簇上的其它RLK基因以及位于其它染色体上的RLK基因也对叶锈菌的企图侵染上调表达(q-RT-PCR检测)。这些RLK基因对不同的叶锈菌小种的反应不同,也对非锈菌的其它小麦非寄主病原反应不同,表明对不同的非寄主病原,水稻品种日本晴有不同的一套基因去监测和反应。3.采用二维电泳分离水稻品种日本晴接种非寄主病原小麦叶锈菌三天后和对照的叶片蛋白,相比于对照,接种叶锈菌的水稻叶片蛋白中33个蛋白点上调,9个蛋白点下调。利用所选蛋白点的基质辅助激光解析飞行时间质谱产生的肽质量指纹图谱鉴定了30个上调和下调蛋白。这些蛋白参与抗刺激/抗性反应,能量/碳水化合物代谢,氧化还原过程,蛋白折叠/转运/分裂/降解,信号转导和细胞死亡调控。结果指出:水稻品种日本晴对小麦叶锈菌的非寄主抗性过程伴随着蛋白和能量代谢的转变,抗微生物活性的增加,可能包括植保素的积累以及细胞壁的加厚,增加细胞修补、抗氧化和脱毒反应,而且抑制细胞的死亡。4.以小麦品种水源11幼苗分别与条锈菌条中CY31和CY23构成的亲和与非亲和组合为材料,采用双向电泳技术对叶片全蛋白进行分离并进行表达谱分析。与对照相比,在接种后24h和72h,41个差异表达的蛋白点被基质辅助激光解析飞行时间质谱所分析(MALDI-TOF MS),这些蛋白点中的23个得到了阳性鉴定。这些鉴定的蛋白主要参与光合,抗氧化,信号转导以及代谢功能。对非亲和反应中诱导蛋白的注释揭示了一个包括诱导激酶信号和活性氧产生的快速的抗性反应,而这发生在R基因介导的抗性中。抗氧化功能的蛋白,例如:抗坏血酸过氧化物酶,抗坏血酸脱氢还原酶和谷胱甘肽-S-转移酶在亲和和非亲和反应中的差异表达表明了在这两种反应中活性氧在侵染组织中的积累不同。此外,在小麦条锈菌侵染的叶片蛋白分离物中,检测到了核酮糖-1, 5-二磷酸脱羧/加氧酶(Rubisco)的片段化,Rubisco的片段化进一步为western blot分析所验证,指出无论在在亲和或非亲和反应中,条锈菌侵染都影响寄主植物小麦的叶绿体以及光合作用。