【摘 要】
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目的运用酵母双杂交技术研究Depp蛋白与Sedlin蛋白的相互作用区域;表达融合蛋白GST-Sedlin,进行GST pull-down实验检测Depp蛋白和Sedlin蛋白在体外的相互作用;构建Depp蛋白和Sedlin蛋白的真核表达载体,共同转染COS7细胞,观察两者在哺乳动物细胞中的共定位情况。方法以pACT2-Depp为模板,PCR扩增Depp蛋白N端300bp和C端339bp的DNA片段
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目的运用酵母双杂交技术研究Depp蛋白与Sedlin蛋白的相互作用区域;表达融合蛋白GST-Sedlin,进行GST pull-down实验检测Depp蛋白和Sedlin蛋白在体外的相互作用;构建Depp蛋白和Sedlin蛋白的真核表达载体,共同转染COS7细胞,观察两者在哺乳动物细胞中的共定位情况。方法以pACT2-Depp为模板,PCR扩增Depp蛋白N端300bp和C端339bp的DNA片段,分别将片段插入到pACT2载体中,构建Depp缺失突变体pACT2- Depp-N300和pACT2-Depp-C339。将两种缺失突变体分别与pAS-SEDL共同转化酵母菌Y190感受态细胞,SD培养基（﹣Trp/﹣Leu/﹣His/+3-AT）上生长,滤膜印迹实验测定β-半乳糖苷酶活性,呈蓝色的克隆为相互作用的阳性克隆。以pAS-SEDL为模板,PCR扩增Sedlin蛋白全长编码序列,目的片段经BamH I和EcoR I酶切后回收,回收片段插入到带GST标签的载体中,构建表达载体pGEX-3X-SEDL。转化大肠杆菌BL21,表达融合蛋白GST-Sedlin,进行GST pull-down实验,检测Sedlin蛋白与Depp蛋白在体外的相互作用;PCR扩增FLAG-Sedlin编码序列,扩增产物插入到载体pCDNA3.1中,构建真核表达载体pCDNA-FLAG-SEDL。通过酶切和测序鉴定后,将质粒pCDGFP-Depp和pCDNA-FLAG-SEDL共同转染COS7细胞,通过免疫荧光的方法观察Depp蛋白和Sedlin蛋白在细胞内的共定位情况。结果经酶切和测序鉴定,各重组质粒均构建正确。通过滤膜印迹实验,转化pAS-SEDL/pACT2-Depp-C339质粒组酵母克隆呈现蓝色;GST pull-down实验表明Depp蛋白和Sedlin蛋白在体外能够相互结合;免疫荧光实验观察到Depp蛋白和Sedlin蛋白在COS7细胞中共同集中分布于细胞核周围集区域。结论Depp蛋白与Sedlin蛋白相互作用的关键区域位于其C端339bp编码112个氨基酸的片段内; GST pull-down实验表明Depp蛋白和Sedlin蛋白在体外可以相互作用;免疫荧光实验说明Depp蛋白和Sedlin蛋白在COS7细胞中集中共定位于细胞核周围区域,提示Depp蛋白和Sedlin蛋白在细胞内的相互作用。
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