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重离子束辐照作为一种先进的、高效的诱变手段,具有高的传能线密度(LET)、高的相对生物学效应(RBE)、高的突变效率等特点,已经广泛应用于工业微生物的育种实践中。本研究采用中能碳离子束对柠檬酸生产菌(黑曲霉)进行辐照处理,一方面通过高通量筛选,获得高产酸的优良柠檬酸生产菌株,满足柠檬酸产业对高产菌株的需求;另一方面通过基因水平的研究,探究重离子束辐照对黑曲霉柠檬酸代谢途径相关基因的突变影响。本论文首先利用流式细胞技术、扫描电镜技术、MTT方法和固体平板方法分析了中能碳离子束辐照对黑曲霉分生孢子生理特性的影响;进而采用发酵法考查了突变菌株和原始菌株积累柠檬酸的差异;最后,采用基因组重测序技术、荧光定量PCR以及酶活性测定等方法,研究了碳离子辐照对黑曲霉柠檬酸代谢途径关键基因的突变影响,着重分析了淀粉降解途径关键基因的表达及酶活性对柠檬酸快速积累的影响。主要研究结果如下:1.碳离子束辐照可以诱导黑曲霉分生孢子的生理特性发生变化。与原始菌株相比,突变菌株HW2的分生孢子直径变小,突变菌株H4的分生孢子直径变大;扫描电镜结果显示,与原始菌株相比,HW2菌株分生孢子表面褶皱的群体数增加,H4菌株则无显著差异;MTT检测孢子活力发现,H4菌株的代谢活力比原始菌株旺盛,HW2菌株的代谢活力与原始菌株无明显差异;菌株的固体平板生长速率试验发现,HW2菌株以葡萄糖、淀粉或木糖为原料时,与原始菌株相比,菌苔直径显著变小,而H4菌株以淀粉或木糖为原料时,菌苔直径显著变大。该结果表明突变菌株与原始菌株相比,生长速率具有明显差异,即H4菌株的生长速率增加,而HW2菌株的生长速率降低。2.碳离子束辐照可以诱导黑曲霉柠檬酸积累发生变化。不同碳源或氮源发酵试验发现,与原始菌株相比,突变菌株HW2、H4和H1的柠檬酸积累具有显著差异,即HW2展现出增强的柠檬酸积累能力,H4和H1的柠檬酸积累能力减弱;与此同时,在利用不同碳源或氮源发酵生产柠檬酸时,与原始菌株相比,突变菌株HW2、H4和H1的菌球形态均呈现出显著差异;10L发酵罐试验结果表明,与原始菌株相比,HW2表现出更好的柠檬酸积累、更低的糖消耗性能,是一株优良的柠檬酸工业生产菌株。3.通过对原始菌株和H4突变菌株基因组差异进行比对,发现碳离子束可以诱导淀粉降解途径的相关基因突变。RT-PCR结果显示,在发酵前期(24h),与原始菌株相比,HW2菌株的糖化酶基因表达量上升,淀粉降解调节基因无明显差异;H4菌株的糖化酶基因表达量、淀粉降解调节基因表达量都明显下降。在发酵后期(48h),与原始菌株相比,H4和HW2菌株的糖化酶基因、淀粉降解调节基因的表达量均无显著差异。糖化酶酶活性测定结果验证了上述基因的表达差异。淀粉降解途径影响黑曲霉积累柠檬酸主要发生在发酵前期,此时,HW2展现出增强的淀粉降解能力,H4表现出减弱的淀粉降解能力,最终诱导HW2表现出增强的柠檬酸积累,H4表现出减弱的柠檬酸积累。综上所述,重离子束可以诱导淀粉降解途径的关键基因突变,影响其基因的表达和关键酶活性,进而影响柠檬酸的积累。本论文成功将重离子辐照诱变技术应用于优良柠檬酸生产菌株选育研究实践中,首次报道了重离子束对黑曲霉分生孢子生理特性的影响;成功选育出一株柠檬酸高产菌株HW2;从基因水平上证明了淀粉降解途径的关键基因表达对柠檬酸的积累有显著影响。