乙肝病毒DNA在人淋巴细胞、精子与小鼠卵母细胞中的存在与整合

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背景 根据流行病学资料,乙肝病毒携带者目前在世界约有2.2亿,在我国为1.2亿左右,约占全国人口的10%。HBV具有严格的嗜肝特异性,但是科学家们在肝外组织和细胞如胰脏、肾脏、皮肤、心脏、骨髓、淋巴细胞甚至男性生殖细胞内发现HBV以游离和/或整合的方式存在。机体细胞内HBV的存在可导致持续感染;HBV DNA整合可诱发多种染色体畸变;若突变激活癌基因,有可能诱发癌变。由于该病危害性大,流行面广,因此其传播途径、发病机理及诊疗手段的研究一直是各国政府和科学家们高度重视的课题。 目的与意义 由于T淋巴细胞在机体清除HBV急慢性感染中发挥重要作用,而HBV DNA整合到精、卵细胞染色体上,有可能在亲婴间进行垂直传播,因此进一步研究患者淋巴细胞与精、卵细胞内HBV DNA的存在与整合,无论是对乙肝病毒的基础理论研究还是临床防治实践都具有重要意义。 材料与方法 材料:①慢性乙肝患者外周血淋巴细胞与精子样本;②小鼠卵母细胞;③pBR322-HBV DNA质粒。方法:①用PCR与电泳技术检测淋巴细胞和精子样本中是否存在HBV DNA;②进行外周血培养制备淋巴细胞染色体,用荧光原位杂交技术(FISH)检测HBV DNA在染色体上的整合;③将小鼠卵母细胞与pBR322-HBV DNA质粒共培养,用斑点杂交、PCR、Southern杂交与FISH技术证实HBV DNA进入卵母细胞并在卵母细胞染色体上整合。 结果 ①20例慢性乙肝患者样本中,7例淋巴细胞与精子样本均见HBV 汕头大学医学院硕士学位论文DNA阳性带;2例淋巴细胞样本为阳性,精子样本为阴性;3例淋巴细胞样本为阴性,精子样本为阳性;8例患者淋巴细胞与精子样本均为阴性;②在患者2000个淋巴细胞中期相中,发现有21个存在HBv DNA整合信号,整合率为1.05%;③共培养结束后,每份卵样洗涤8次,最后3次洗液经斑点杂交检测HBv DNA阴性;共培养卵母细胞DNA扩增产物电泳分析均见HBV DNA阳性带;Southem发现共培养卵母细胞样本均有HBV DNA杂交带;对638个共培养卵母细胞FISH,观察到5个有HBV DNA整合信号,整合率为0.8%。结论①HBv DNA能够进入患者淋巴细胞和精子细胞内;血样检出HBvDNA阴性者,其精样可能是阳性,反之亦然。因此在临床诊断时应作全面检查,而在治疗时应根据不同的检测结果做出不同的治疗方案。②I」BVDNA能够整合在淋巴细胞染色体上。鉴于HBV DNA整合可能使淋巴细胞功能基因封闭,建议临床治疗应考虑HBV在淋巴细胞染色体上的整合状态。③HBV DNA能够进入小鼠卵母细胞并能整合到卵母细胞染色体上。首次建立了在体外实验中研究卵母细胞捕获病毒基因的实验模型,在医学上为进一步研究“病毒基因母婴垂直传播途径”奠定了基础;在生产实践中为进行经济动物转基因研究提供了新思路,展示了新途径。
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