目的:通过观察皮肤破损、激素干预、异物植入3种因素对小鼠皮肤溃疡创面的影响,探讨最符合临床慢性皮肤溃疡特点的复合因素叠加造模方法,为进一步研究提供理想的动物模型。并在此基础上观察一效膏对慢性皮肤溃疡小鼠创面愈合的影响,探讨其促进创面愈合的作用机制。材料与方法:实验一:清洁级昆明种小鼠,50只,均为雄性,体重20-22g。随机数字表法随机分为:皮损+激素+异物组、皮损+激素组、皮损+异物组、单纯皮损组、空白组;每组各10只小鼠。皮损+激素+异物组与皮损+激素组小鼠连续3天股部肌注氢化可的松注射液4ml/kg,其余各组小鼠注射等量生理盐水。于造模第4天用4%水合氯醛麻醉后,剪去背部毛,在腰椎正中部减除部分皮肤,造成直径大约为1.2cm的圆形皮肤全层切口。皮损+激素+异物组、皮损+异物组小鼠于皮肤切开后同时用血管钳将皮肤组织分离至肌筋膜,然后用镊子轻轻拉开切口,将消毒的塑料环边缘埋入切口内,最后将紧靠塑料环边缘的皮肤缝合二针,以防环脱落。造模成功后观察小鼠一般状态、疮面形态、分泌物,定期称量小鼠体重,测量创面面积并计算创面愈合率,造模后14天处死小鼠,剪下创面新生肉芽组织及创周组织,行HE染色观察创面组织毛细血管新生及成纤维细胞增殖情况。实验二:清洁级昆明种小鼠40只,随机分为空白组、模型组、一效膏组、康复新液组,每组各10只,除空白组外,各组小鼠采用皮损+激素+异物组方法造模,各治疗组给予相应药物,模型组予生理盐水涂抹创面,各组均每日换药一次,以无菌纱布覆盖创面,空白组不予干预。治疗后定期肉眼观察小鼠创面大体情况,测量创面面积并计算创面愈合率,于治疗后第21天处死小鼠,取塑料环内肉芽组织,用电子天平称取肉芽肿湿重,然后以10%福尔马林溶液固定保存,HE染色进行形态学观察,免疫组化法检测创面组织中bcl-2、bax蛋白表达水平。实验三:清洁级昆明种小鼠120只,随机分为空白组、模型组、一效膏组、康复新液组,每组各30只,每组在其基础上再分为一周组、二周组、三周组3个亚组,每组各10只小鼠。各组小鼠于规定时间结束观察,处死后,取塑料环内肉芽组织,1/3浸入10%福尔马林溶液固定保存,做组织学观察、免疫组化法检测用。2/3放入冻存管内超低温冰箱保存,作real-timepcr检测用。观察指标:血管内皮生长因子(vegf),成纤维细胞生长因子(fgf),转化生长因子(tgf-β),cd34抗原,及成纤维细胞(fb)计数。结果:实验一:1.一般状态:造模1周后皮损+异物组、单纯皮损组小鼠活动状态较好,运动灵敏,进食良好,大便成形,体态与空白组相比略显瘦削。皮损+激素+异物组与皮损+激素组体态明显消瘦,进食量少,大便稀薄不成形,活动量明显减少,蜷缩,四肢及尾部冷。2.创面情况:单纯皮损组疮面于造模后第3天即出现鲜红肉芽组织,创面湿润,少量浆液性渗出,创面平坦,无明显结痂,愈合速度快。皮损+激素组疮面颜色暗淡,分泌物清晰,肉芽组织量少且不鲜嫩,创面愈合较单纯皮损组慢。皮损+异物组初期即有大量稠厚黄白色分泌物,分泌物下创面基底组织颜色鲜红,后期转为暗红,创面结痂较厚,愈合趋势不明显。皮损+激素+异物组,初期有大量清晰分泌物,中后期疮形散漫,平坦塌陷,色泽紫暗,肉芽苍白并被结痂覆盖,愈合趋势不明显。3.体重情况:造模当天各组小鼠体重无明显差异,造模后第1周各组体重比较,单纯皮损组体重增长最快,皮损+激素+异物组体重增长最慢。析因设计方差分析表明,激素注射与异物植入两种因素对小鼠体重变化均有影响。4.造模后各组小鼠创面愈合率比较,单纯皮损组愈合速度最快,皮损+激素+异物组最慢。5.组织学观察:单纯皮损组切片中可见较多新生排列整齐的毛细血管,伴有大量成纤维细胞,少量纤维母细胞及萎缩的炎性细胞,无明显水肿。皮损+激素组切片可见新生毛细血管及成纤维细胞排列较为稀疏,可见炎性细胞。皮损+异物组切片显示大量萎缩的炎性细胞,偶可见巨噬细胞及浆细胞,大小血管排列杂乱且部分破裂,红细胞溢出散落于组织间隙,并伴有水肿。皮损+激素+异物组切片可见毛细血管生成及成纤维细胞稀少,排列杂乱,可见炎性细胞。空白组皮下组织切片可见肌纤维排列整齐有序,无炎性细胞浸润。实验二:1.创面大体观察:一效膏组小鼠创面用药后第3-7天创面色泽由晦暗转红活,出现肉芽组织,创面湿润,较多稠厚分泌物,无明显结痂,触之较软,愈合趋势明显;康复新液组小鼠用药后第3-9天可见少量肉芽组织,色泽尚红活,表面较为干燥,分泌物清晰,少许结痂覆盖,愈合趋势较明显;模型组小鼠创面色泽晦暗,疮形散漫,平坦塌陷,愈合早期无明显肉芽组织,致中后期依稀可见少许苍白肉芽,表面被结痂覆盖,触之较硬,无明显愈合趋势。2.创面愈合率:治疗第5天,各治疗组与模型组比较,一效膏组、康复新液组创面愈合率明显提高(p<0.05)。治疗第10天,各治疗组与模型组比较,一效膏组、康复新液组创面愈合率明显提高(p<0.05);一效膏组与康复新液组比较,差异无统计学意义。治疗第17天,与模型组比较,一效膏组、康复新液组创面愈合率明显提高(p<0.05)。3.创面肉芽组织湿重:用药后21天,各治疗组与模型组相比,一效膏组与康复新液组小鼠创面塑料环内肉芽组织湿重明显提高(p<0.05)。4.创面bcl-2、bax蛋白表达:各治疗组与模型组相比,一效膏组与康复新液组小鼠创面肉芽组织内bcl-2表达明显升高(p<0.001),而bax表达明显降低(p<0.001)。5.组织学观察:正常组皮下组织切片可见肌纤维排列整齐有序,无炎性细胞浸润。模型组肉芽组织增生不明显,毛细血管数量稀疏,排列杂乱,内皮细胞与成纤维细胞数量稀少,可见炎性细胞,瘢痕增生明显。一效膏组肉芽组织增生较明显,毛细血管生成明显较模型组多,排列整齐,伴有大量成纤维细胞及少量纤维母细胞,偶可见少量炎性细胞,瘢痕增生不明显。康复新液组毛细血管生成、成纤维细胞情况与一效膏组相似,可见少量瘢痕组织。实验三:1.成纤维细胞计数:各治疗组与模型组比较,用药后第7、14、21天,一效膏组与康复新液组成纤维细胞计数明显提高(p<0.05)。2.cd34结果:各时间点,模型组cd34蛋白表达水平均明显高于空白组(p<0.01);与模型组相比,各治疗组cd34蛋白表达水平明显提高(p<0.01)。3.vegf结果:免疫组化:各时间点,模型组vegf蛋白表达水平均明显高于空白组(p<0.05)。与模型组比较,各时间点一效膏组vegf蛋白表达均水平均有所提高,其中第7、14天两组间比较差异有统计学意义(p<0.05),与模型组比较,各时间点康复新液组vegf蛋白表达均有所提高,其中第14天两组间比较差异有统计学意义(p<0.01)。rt-pcr:各时间点模型组vegfmrna表达水平均高于空白组(p<0.05)。与模型组比较,各时间点治疗组vegfmrna表达水平均有所提高(p<0.05)。4.fgf结果:免疫组化:各时间点,模型组fgf蛋白表达水平均明显高于空白组(p<0.01)。与模型组比较,各时间点一效膏组FGF蛋白表达均水平均有所提高,其中第14天两组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较,各时间点康复新液组FGF蛋白表达均有所提高。RT-PCR:各时间点模型组FGF mRNA表达均高于空白组,其中第7天两组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,各时间点,一效膏组FGF mRNA表达均有所提高(P<0.01)。与模型组比较,各时间点康复新液组FGF mRNA表达均有所提高。5.TGF-β结果:免疫组化:各时间点,模型组TGF-β蛋白表达水平均高于空白组(P<0.05)。与模型组比较,各时间点一效膏组TGF-β蛋白表达均水平均有所提高,其中第7、14天两组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,各时间点康复新液组TGF-β蛋白表达均有所提高,其中第7、14天两组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR:各时间点模型组TGF-βmRNA表达均高于空白组(P<0.05)。与模型组比较,各时间点一效膏组TGF-βmRNA表达水平有所提高(P<0.05,P<0.01)。与模型组比较,康复新液组TGF-βmRNA表达水平有所提高,其中第14、21天差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论:1.皮肤缺损叠加激素注射与异物植入的复合因素造模方法,能有效维持创面慢性皮肤溃疡的状态,且符合中医外科阴症疮疡的证候特点。2.一效膏能有效促进慢性皮肤溃疡创面的愈合,提高创面愈合率,并能促进创面肉芽组织的生成,其作用机制可能与上调bcl-2表达水平,下调bax表达水平有关。3.一效膏能通过上调VEGF、FGF、TGF-β表达水平,促进创面毛细血管的新生和成纤维细胞的增殖,进而促进慢性皮肤溃疡创面的愈合。