目的:非酒精性脂肪肝病(Nonalcoholic Fatty Liver Disease,NAFLD)是以肝细胞中脂质累积为特征的代谢疾病,与肥胖症、2型糖尿病、高脂血症和胰岛素抵抗有一定关联性。ABC转运蛋白(ATP binding cassette transporter)可以在ATP的水解作用中获得能量,对脂质等多种物质进行跨膜转运。ABCA6是ABCA家族中的一员,在肝脏中含量最为丰富。我们课题组之前的研究结果:ABCA6转运蛋白有可能具有转运脂肪酸氧化中间产物的作用。目前对于ABCA6在NAFLD中的作用尚不清楚。在本研究中,我们观察了ABCA6缺失对高糖高脂饮食诱导的小鼠NAFLD的作用,并对其作用机制进行了初步探讨。方法:以60%高脂肪饮食配合30%果糖水喂养6个月的方法构建小鼠NAFLD模型。通过Western Blot(WB)检测小鼠肝脏中ABCA6蛋白的表达水平。定期称量小鼠体重并绘制体重增长曲线;进行胰岛素、葡萄糖、丙酮酸耐量代谢实验;造模结束后收集两组小鼠肾周和性腺周脂肪组织并称重。收集血清并测定其的中甘油三酯(TG)、总胆固醇(T-CHO)、葡萄糖、β-羟丁酸、MDA、谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)等的水平。造模结束取小鼠的肝组织,HE染色观察肝脏形态学变化,并测定肝脏中T-CHO和TG水平。我们利用实时定量荧光PCR技术(Real-time PCR)检测肝脏中炎症的因子、纤维化因子、氧化应激基因、脂肪酸氧化基因、脂肪酸生成及糖异生相关基因的mRNA的表达。通过Western Blot(WB)检测MAPK信号通路中P38、Erk、JNK的磷酸化情况,纤维化相关的α-SMA表达水平,以及与胰岛素抵抗相关的AMPKα的磷酸化情况。在体外实验中,分别提取野生(WT)小鼠和ABCA6 KO小鼠原代肝细胞,给予PA(棕榈酸)刺激,通过MTT测定细胞存活率。通过油红0染色观测脂质摄取改变情况,并测定细胞中TG和TCHO水平。通过Real-time PCR检测两种基因型原代肝细胞在PA刺激后炎症因子的表达变化情况。为了测定ABCA6缺失对肝星状细胞的活化情况,我们分别收集WT和ABCA6 KO小鼠的原代肝细胞给予PA刺激72小时后的培养基,用来刺激人肝星状细胞LX-2细胞系和大鼠肝星状细胞HSC-T6细胞系,通过Real-time PCR测定纤维化基因的表达情况。结果:高脂高糖饮食喂养6个月后,WT小鼠ABCA6蛋白水平明显减少;与WT小鼠相比,ABCA6 KO小鼠体重明显升高,附睾脂肪重量/体重显著高于WT小鼠。HE染色显示,ABCA6 KO小鼠肝脏脂肪大量储积,肝脏中的TG和TCHO含量升高。高脂高糖饮食造模6个月后,ABCA6 KO小鼠血清中血糖、总胆固醇、MDA、酮体及谷丙转氨酶(ALT)均高于WT小鼠。代谢实验结果表明,高糖高脂饮食喂养的ABCA6 KO小鼠对胰岛素的敏感性下降。定量RT-PCR检测显示,ABCA6KO小鼠在高糖高脂喂养下肝脏炎症因子IL-b表达升高,胶原蛋白COL1A1、COL1A2表达增加,促氧化应激基因NOX2表达升高,抗氧化应激基因SOD表达下降;促进脂肪酸氧化的PDK4、UCP-2表达升高;Western Blot(WB)显示α-SMA表达上调,AMPKα信号通路被激活,MAPK信号通路Erk磷酸化水平被抑制。用PA处理原代肝细胞后,和WT肝细胞相比,ABCA6 KO原代肝细胞存活率明显下降;油红O染色可见ABCA6 KO肝细胞的脂质沉积更明显;RT-PCR检测发现,在PA处理后,ABCA6 KO肝细胞表达的MCP-1 mRNA明显高于WT肝细胞。PA处理的ABCA6 KO肝细胞的条件培养基显著增加了LX-2和HSC-T6星状细胞COL1A2的表达,提示ABCA6缺失的肝细胞在PA的刺激下对肝星状细胞的活性作用增强。结论:ABCA6基因缺失对高糖高脂饮食诱导的小鼠NAFLD有加重的作用。ABCA6 KO小鼠肝脏脂质贮积增多,对胰岛素的敏感性降低,氧化应激水平升高,肝脏的炎症反应和纤维化加重。ABCA6缺失增加了棕榈酸对肝细胞的脂毒性,增强了肝细胞对肝星状细胞的激活作用。这些改变与ABCA6缺失引起的肝脏脂肪酸氧化障碍并通过激活AMPKα而增加食物摄入有关。