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目的 病毒性流感是我国乃至WHO认定的重大传染病,疫苗不能有效预防其暴发与流行,抗流感药物耐药现象较为普遍,防治流感已成为亟待解决的医学问题。本文研究白及菲类化合物的抗流感病毒药效,并从干预病毒吸附、病毒复制、病毒释放及调节宿主基因表达和细胞因子探讨其作用机制,为白及用于流感的防治提供科学依据。方法1.通过建立流感病毒A/Sydney/5/97（H3N2）鼠肺适应株感染小鼠模型试验考察白及醇提物抗流感病毒药效。建立流感病毒感染BALB/c小鼠模型,设置阳性药物达菲组（0.03g/kg）,计算肺指数及肺指数抑制率,RT-PCR检测肺组织中的病毒载量,HE染色观察肺组织的病理改变,评价白及醇提物在小鼠模型中抗流感病毒药效。2.利用流感病毒感染鸡胚模型及MDCK细胞模型研究白及菲类化合物的抗流感病毒药效。将白及菲类化合物与等量的100EID50病毒液37℃孵育1h,接种鸡胚尿囊腔,34℃孵育48h后收集尿囊液测其血凝效价并计算抑制率,评价白及菲类化合物抗流感病毒药效。MDCK细胞在细胞培养板中长成完全单层后,以三种不同的加药方式,即在病毒感染的18h前用菲类化合物处理细胞（前处理实验）;病毒与菲类化合物同时加入细胞（同时处理实验）;病毒感染细胞1h后,菲类化合物处理细胞（后处理试验）,然后观察细胞病变效应（CPE）,计算白及菲类化合物的抑制率、半数有效浓度(IC50)及选择性指数（SI）,评价白及菲类化合物在细胞模型的抗流感病毒药效。3.采用流感病毒感染MDCK细胞模型及小鼠模型研究白及提取物抗流感病毒机理。在细胞模型中,从流感病毒吸附、复制、释放及宿主方面着手:以红细胞凝集情况及CPE为指标,评价白及菲类化合物抗流感病毒吸附作用。病毒感染18h后提取细胞内病毒基质蛋白mRNA,荧光定量RT-PCR检测病毒基质蛋白mRNA合成量,研究白及菲类化合物对病毒复制过程影响。白及菲类化合物干预神经氨酸酶与有荧光特性的特异性底物的酶促反应,通过检测酶催化产物,研究白及菲类化合物对神经氨酸酶活力的影响。通过检测白及菲类化合物对神经氨酸酶活力的影响,研究其对流感病毒释放的抑制作用。通过对宿主细胞的表达谱分析,对发生差异变化的基因进行Go分类,并采用KEGG数据库分析细胞信号通路中的差异表达基因,并进一步进行荧光定量PCR验证,表明白及醇提物对宿主细胞信号通路中的基因的影响。建立流感病毒感染小鼠模型,采用ELISA的方法测定小鼠血清中IL-2、IFN-α和IFN-β含量,观察白及醇提物对流感病毒感染小鼠血清中炎性细胞因子分泌水平影响。结果1.流感病毒感染小鼠后,模型组小鼠的肺指数持续增加。在第3、5、7d,达菲组（0.03g/kg?d）及白及醇提物高剂量组（8g/kg?d）肺指数均低于模型组,且差异有统计学意义（p<0.01）。白及醇提物肺指数抑制率最高达35.8%,而达菲组最高可达47.2%。因此,以肺指数及肺指数抑制率为观察指标,表明白及醇提物高（8g/kg?d）、中（4g/kg?d）剂量组对流感感染小鼠具有保护作用。HE染色观察达菲组（0.03g/kg?d）及高剂量组（8g/kg?d）肺组织的病理改变也相对于模型组有所改善。RT-PCR检测肺组织中病毒载量,达菲组（0.03g/kg?d）、高剂量组（8g/kg?d）与模型组相比病毒载量在第3、5、7d显著减少,具有统计学差异（p<0.01）。表明白及高剂量组（8g/kg?d）可以减少病毒在肺组织的增殖。2.通过检测病毒血凝效价和抑制率评价白及菲类化合物在鸡胚模型及细胞模型上的抗流感病毒药效。鸡胚模型结果显示,与病毒对照组相比,除了化合物7,其余11种化合物均可降低流感病毒的血凝滴度,且具有明显的剂量依赖效应。其中化合物4（0.16μmol/每胚）、化合物6（0.16μmol/每胚）、化合物9（0.16μmol/每胚）抑制率可达到100%;在细胞模型中,同时处理及后处理实验结果表明,菲类化合物2、3、4、6、7、10、11表现出一定的抗流感病毒活性,其中化合物4在此实验中抗流感病毒活性最显著。结果表明,白及菲类化合物在鸡胚模型及细胞模型中均具有较好的抗流感病毒药效。3.红细胞凝集试验及CPE结果表明:菲类化合物不能抑制流感病毒的吸附来发挥抗流感病毒作用;荧光定量RT-PCR结果表明化合物2、3、4、6、7、9、10、11明显抑制流感病毒基质蛋白mRNA合成（p<0.01）,其中菲类化合物4效果最为显著。神经氨酸酶抑制试验表明化合物3、4、6可以有效地抑制神经氨酸酶酸酶活性阻断病毒释放。综上所述,白及菲类化合物可以干预流感病毒复制、释放来发挥抗流感病毒作用。选取最佳作用时间点的样本送检进行细胞的基因表达谱分析,获得856个上调基因,占总基因的2.62%;1158个下调基因,占总基因的3.54%;采用RT-PCR方法获得5个与甲型流感病毒相关性显著的差异基因,其中上调基因PI3K、IκB、HSP70表达量分别上升为17.88倍、18.25倍、12.13倍;下调基因RIG、PKR4表达量分别下降为20.53倍、6.23倍。荧光定量PCR和基因表达谱分析结果相符。测定小鼠血清中IL-2、IFN-α和IFN-β含量,表明白及醇提物在小鼠体内可升高血清IL-2、IFN-α和IFN-β水平从而增强小鼠免疫功能发挥抗流感病毒作用。结论 白及菲类化合物在小鼠模型、鸡胚模型及细胞模型均具有较好的抗流感病毒药效。白及菲类化合物可以通过干预流感病毒复制周期中复制、释放环节,调节宿主细胞基因表达及免疫细胞因子发挥抗流感病毒作用。