背景LIMS1也称PINCH1(particularly interesting new cysteine-histidine rich protein)最早是于1994年Rearden教授在人类衰老红细胞cDNA文库中发现[1]。LIMS1是由5个串联的LIM1结构域以及一个短小的C尾末端构成[2]。LIMS1参与胚胎的发育与成熟,并对一些器官如心,肺,胰腺等的功能维持中发挥了重要的作用。经过我们前期实验结果提示:与正常的胰腺组织及胰腺细胞导管细胞相比,来源与胰腺导管腺癌患者的手术标本及胰腺癌细胞系中的LIMS1表达量有一个明显上升的趋势,我们进一步设计该实验从而探索LIMS1在胰腺癌中高表达的生存预后意义以及和各个临床参数的关系,功能作用,其背后的调控机制,目的是从临床水平、细胞功能水平、分子生物学水平及动物实验水平深入探索胰腺导管腺癌中LIMS1的功能与意义.方法1.应用胰腺导管腺癌组织石蜡标本,进行对LIMS1及HIF1a的连续切片空间共定位染色,之后从组织蛋白表达水平来分子两者相互关系;并结合使用病例的生存预后信息,综合分析LIMS1的表达水平与各个临床病理参数之间的关联性大小。2.应用蛋白质印迹法(免疫印迹试验)、实时定量PCR等实验技术检测实验室具有的胰腺癌5个细胞系以及正常胰腺导管细胞系的LIMS1及HIF1α的表达水平并分析其相关性;采用免疫荧光技术检测LIMS1在胰腺癌细胞中的空间表达细胞定位。3.应用分子克隆方法构建LIMS1,HIF1a过表达质粒以及LIMS1,HIF1a的short hairpin RNA降表达质粒,建立稳定转染细胞系;用WB、RT-PCR及检测所构建稳系表达LIMS1及HIF1a水平。4.采用低氧低糖环境处理过表达及降表达LIMS1稳系看LIMS1对胰腺癌细胞抵抗不利生存环境所起的作用。5.应用Western blot、RT-PCR、糖摄取试剂盒检测LIMS1参与肿瘤抗凋亡分子机制。6.构建NOD-SCID小鼠胰腺癌皮下成瘤模型;体内验证LIMS1对胰腺癌肿瘤大小发挥的影响。并采用小动物PET-CT,体外验证其机制。结果1.LIMS1在胰腺导管腺癌PDAC及其相应癌旁正常组织免疫组化表达水平及其表达含义。我们通过对搜集的115例手术标本经行了临床相关性分析,并从其中随机抽取8例标本经行western,RT-PCR发现,与癌旁正常组织相比LIMS1在胰腺癌中呈现高表达趋势,且LIMS1的高表达与胰腺癌患者的生存预后呈负相关(p<0.05*),来自与TCGA(The Cancer Genome Atlas)的数据给与我们相同的答案。进一步对LIMS1与临床病理参数分析发现LIMS1与胰腺癌肿瘤大小,T分期,N分期,TNM分期以及血管侵犯相关(p<0.05*),TCGA数据库的数据也提示LIMS的表达情况与肿瘤T分期,N分期,TNM分期,血管侵犯以及肿瘤分化相关。以上信息提示我们LIMS1影响胰腺癌肿瘤大小。2.LIMS1对胰腺癌抗低氧低糖发挥的作用。我们成功构成了两个过表达LIMS1的细胞系(BXPC3,CFPAC)以及两个降表达LIMS1的细胞稳系(PANC-1,与MIA-Paca2)我们将稳系及对照组细胞在常规培养环境下处理后检测其凋亡环境并没有明显差异,当我们将培养条件模拟体内肿瘤的低氧低糖微环境后发现与对照组相比LIMS1过表达组生存活性较好凋亡较少,反之与降表达相比其活性较差凋亡较多。用稳系及对照组在小鼠皮下成瘤发现过表达LIMS1组与对照组相比肿瘤体积更大,肿瘤凋亡更少,相应的降表达组体积较小凋亡较多。3.LIMS1通过参与肿瘤细胞糖代谢来发挥抗凋亡的作用。利用糖摄取实验发现在低氧低糖环境下LIMS1与肿瘤细胞葡萄糖摄取能力呈现正相关。原位成瘤的小鼠及临床病人数据也验证了这一说法。根据文献报道AKT通路可以被LIMS1激活,且AKT通路还影响细胞葡萄糖摄取蛋白(GLUT1)的表达与分布。我们发现LIMS1确实是通过AKT通路影响了肿瘤细胞抗凋亡的能力。4.HIF1a能转录调控LIMS1。在低氧环境下处理胰腺癌细胞系发现LIMS1的表达明显上升。胰腺癌低氧环境下发挥主要作用的是HIF1a,LIMS1在HIF1a稳系与HIF1a的表达量一致。HIF1a可以结合在LIMS1的启动子区并起始LIMS1的转录。5.LIMS1可以调控HIF1a的翻译。我们发现在LIMS1的稳系中HIF1的表达量与同LIMS1表达呈现正相关。通过阻断实验我们发现LIMS1可以通过AKT/mTOR/4EBP1来调控HIF1a的翻译。6.LIMS1与HIF1a呈现极高相关性。通过胰腺癌手术患者标本连续切片共定位以及过表达HIF1a及LIMS1稳系成瘤可以发现LIMS1与HIF1a呈现明显良好正相关性。7.LIMS1是HIF1a发挥抗凋亡作用的重要途径。通过对过表达HIF1a稳系及过表达HIF1a后降表达LIMS1的稳系与对照度组相互比较可以发现LIMS1-HIF1a对胰腺癌细胞对抗低氧低糖微环境发挥重要作用。结论1.LIMS1蛋白在胰腺癌组织及细胞系中过表达;胰腺癌组织LIMS1表达水平较高的患者预后较差。2.LIMS1可以激活AKT通路从而调控GLTU1在胰腺癌细胞中的表达量及分布情况从而发挥抵抗肿瘤局部低氧低糖环境。3.HIF1a可以起始LIMS1的转录,而LIMS1又可以调控HIF1a的翻译,二者相辅相成组成的调控环对于胰腺癌细胞发挥抗凋亡发挥作用。