植物源舒缓活性物质的筛选及其活性研究

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由于受到环境污染、社会压力和自身因素的影响,敏感性皮肤的发生率日渐增长,人们对具有舒缓皮肤敏感的功效性护肤品的需求大大增加,加之对绿色安全化妆品的追求,使得天然舒缓活性物质的研究成为了一个热门的方向。敏感性皮肤的发生涉及多个层面,其中皮肤屏障功能受损是导致敏感性皮肤发生最主要的原因,故维持和修复皮肤屏障功能是舒缓皮肤敏感的主要方法。目前舒缓功效评价相关的试验方法主要包括抗溶血实验、抗氧化实验、抗过敏实验和抗炎实验等。本文以舒缓活性为导向,首先对可能具有较好舒缓活性的植物原料进行筛选,再对筛选得到的原料进行提取和分离纯化,分析鉴别其中的主要活性成分,并从多维度评价活性组分的舒缓功效,为植物源舒缓活性物质的开发提供科学依据。主要研究内容如下:(1)在文献研究基础上选取22种可能具有舒缓活性的植物原料,分别以水进行提取;分别通过溶血实验、抗溶血实验和透明质酸酶抑制实验检测22种提取物的舒缓活性,结果表明,山茱萸的舒缓活性最佳,其在生药浓度为200 mg/m L时,溶血率为-1.6±0.3%,溶血抑制率为81.2±1.0%,在生药浓度为400 mg/m L时,透明质酸酶抑制率为99.6±7.4%。(2)以透明质酸酶抑制活性为指标,筛选山茱萸中舒缓活性组分。首先以75%乙醇溶液为溶剂提取得到山茱萸粗提取物,再以梯度萃取法得到四个不同极性部位。透明质酸酶抑制实验结果表明,山茱萸石油醚部位的舒缓活性最高,IC50值为3.11 mg/m L;采用快速制备色谱法对山茱萸石油醚部位分离纯化,获得18个组分,依次命名为COPE-1~18,以透明质酸酶抑制法检测各组分的舒缓活性,结果表明,组分COPE-7、COPE-8、COPE-9、COPE-10的活性较为突出,IC50值分别为1.12、1.07、0.87、1.04 mg/m L;采用GC-MS对组分COPE-7、COPE-8、COPE-9、COPE-10进行成分分析,结果表明,山茱萸中舒缓活性物质主要为萜类物质,包括羽扇豆醇、α-香树脂醇、β-香树脂醇、δ-14-千层塔烯、乌苏-12-烯-28-醛。(3)通过细胞脱颗粒抑制实验、抗炎实验和抗氧化实验评价山茱萸活性组分的舒缓功效。采用MTT法分别检测组分COPE-7、COPE-8、COPE-9、COPE-10对RBL-2H3细胞、RAW264.7细胞和Ha Ca T细胞的毒性,结果表明,组分COPE-7在0~40μg/m L浓度范围内对3种细胞活力均无影响,组分COPE-8在0~20μg/m L浓度范围内对RBL-2H3细胞和RAW264.7细胞活力均无影响,在0~40μg/m L浓度范围内对Ha Ca T细胞活力无影响,组分COPE-9和组分COPE-10在0~1.25μg/m L浓度范围内对3种细胞活力均无影响;通过RBL-2H3细胞脱颗粒抑制实验检测组分COPE-7、COPE-8、COPE-9、COPE-10在钙离子载体A23187诱导的RBL-2H3细胞脱颗粒模型中的作用,结果表明,组分COPE-8对RBL-2H3细胞脱颗粒的抑制作用最好,其在20μg/m L浓度下将组胺释放率降至54.3±0.9%,抑制率为76.2±1.1%,将β-氨基己糖苷酶释放率降至60.8±3.3%,抑制率为43.9±4.9%;采用ELISA试剂盒检测组分COPE-7、COPE-8、COPE-9、COPE-10在LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型中的作用,结果表明,组分COPE-7对细胞因子分泌的抑制作用最好,其在40μg/m L浓度下将细胞因子TNF-α表达量降至526.9pg/m L,抑制率为71.3±4.6%,在10μg/m L浓度下将细胞因子IL-6表达量降至304.9pg/m L,抑制率为80.5±0.5%;采用DPPH法、ABTS法、FRAP法和ORAC法检测组分COPE-7、COPE-8、COPE-9、COPE-10的抗氧化活性,结果表明,组分COPE-7和COPE-10的抗氧化活性较为突出,其在1 mg/m L浓度时的DPPH自由基清除率分别为32.9±1.0%和19.5±1.2%,ABTS自由基清除率分别为20.6±2.2%和12.2±1.1%,FRAP值分别为40.6±12.8和315.9±21.9,在0.1 mg/m L浓度时的ORAC值分别为331.6±30.5μmol TE/g和323.9±40.6μmol TE/g;采用CAA法检测组分COPE-7、COPE-8、COPE-9、COPE-10的细胞抗氧化活性,结果表明,组分COPE-7和COPE-8的抗氧化活性更好,在40μg/m L浓度下的CAA值分别为93.9±2.1和78.6±0.9。
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