妇科阴道炎对女性健康的影响十分严重,其中,以细菌性阴道病（BV）和外阴阴道念珠菌病（VVC）最为常见,约70%以上和30%-50%的女性一生中至少感染一次BV和VVC。且众多属于经常感染,亦难治愈,而BV、VVC患者细菌和真菌产生的生物被膜和对抗生素的持续耐药性被认为是发病的常见因素^[1-4]。在临床治疗上,常使用外用药物双胍类消毒剂和防腐剂醋酸氯己定（CHA）进行抗菌治疗。但高浓度的CHA会刺激粘膜,有些病人长期或经常使用的过程中会产生过敏反应及副作用。越来越多的研究表明,抗菌肽（AMP）具有广谱、快速的抑菌活性、不易受到细菌和真菌对传统抗生素耐药突变的影响,与抗菌药物具有良好的协同效应等优点,逐渐成为新型抗感染药物的重要候选分子,但存在成本等问题。基于此,本研究拟就抗菌肽和CHA进行联合用药的抗菌策略问题进行研究,包括抗细菌活性、抗真菌活性以及抗相应的生物被膜的活性和作用机理,希望通过联合用药,旨在不仅可以发挥其强大的活性潜能,还能降低成本、减少用药量、降低药物本身的毒性和过敏性等不利因素。1.HPRP-A1/HPRP-A2和CHA联合用药的抗细菌和真菌活性研究我们选择α-螺旋阳离子抗菌肽HPRP-A1和它的对映异构体HPRP-A2与CHA分别进行单独或联合用药,并通过在体内和体外实验对其抗革兰氏阴性菌、革兰氏阳性细菌和一种真菌的抗菌活性进行研究。体外研究结果显示,单独用药中,HPRP-A2抗菌活性比HPRP-A1略高,CHA则显示出较弱抗菌活性。结合到抗菌肽的抗菌机理及活性影响因素,即HPRP-A1和HPRP-A2的抗细菌和抗真菌机理和手性特性无关,抗菌活性取决于α-螺旋和两亲结构的影响^[5],我们推测这可能是归功于D-型的HPRP-A2对蛋白酶降解的稳定造成的。有趣的是,与单独用药组相比,联合用药组对革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌和一种真菌显示出更强的抗菌活性,且除了金黄色葡萄球菌具有相加作用外,联合用药组对其他细菌和真菌均具有协同抗菌作用,而溶血活性明显降低,证实其降低了药物的毒性。细菌和真菌阴道炎动物模型的体内研究证实,HPRP-A2和CHA联合用药后,高浓度组抑菌率达到99.9%（P<0.001）,对阴道炎的症状有非常明显的改善。2.HPRP-A1/HPRP-A2和CHA联合用药作用机理研究为了研究HPRP-A1/HPRP-A2和CHA联合用药抑制细菌和真菌的作用机理,用激光共聚焦显微镜、流式细胞术等技术分析了细胞膜的完整性、细菌细胞壁的LPS结合能力、细胞内产生的活性氧和与DNA的结合能力。实验结果表明:单独的抗菌肽比CHA能快速的破膜,抗菌肽和CHA联合用药比单独用药对细菌和真菌细胞膜的完整性影响更为明显,更能快速破坏细菌膜的完整性。HPRP-A1/HPRP-A2单独用药与外源革兰氏阴性细菌大肠杆菌E.coli 055:B5中LPS孵育后表现出显著的结合能力;CHA与LPS的结合能力相对较弱;联合用药后,虽然都能与LPS相结合但与单独药物组相比结合能力并没有明显提高。推测:药物对LPS的抑制可能是抗菌肽的作用机理之一。HPRP-A1/HPRP-A2和CHA单独或联合用药均不会产生ROS,真菌的耗氧量没有增加;HPRP-A1/HPRP-A2与CHA单独用药与对照组无显著性差异（P>0.05）;联合用药组分别与HPRP-A1/HPRP-A2单独用药组和对照组比较无显著性差异（P>0.05）,与CHA单独组有非常显著性差异（P<0.01）。抗菌肽HPRP-A1/HPRP-A2在较高浓度时可与革兰氏阴性细菌细胞核中的DNA结合,CHA在较高浓度时则不能与DNA结合,说明抗菌肽HPRP-A1/HPRP-A2的抑菌活性不仅取决于穿透细胞膜的能力,还可能与细菌LPS和DNA的结合能力有关。3.HPRP-A1/HPRP-A2和CHA联合用药抗细菌和真菌生物被膜活性对HPRP-A1/HPRP-A2和CHA联合用药对处理细菌和真菌产生的生物被膜的活性研究证实,与之前测定的抑制细菌和真菌的最低抑制浓度（MIC）值相比,单独的HPRP-A1/HPRP-A2和CHA组分别对不同细菌和真菌的抑制最低生物被膜浓度（MBIC）的数值均有所增高,联合用药组在细菌和真菌的处理中均具有协同作用;单独抗菌肽或CHA均能预防生物被膜的生成,细菌或真菌生物被膜的生物量逐级减少;当抗菌肽或CHA的浓度达到MIC时,对生物被膜的预防作用最强,显示抗菌肽和CHA均对预防细菌和真菌的粘附有剂量依赖性抑制作用。HPRP-A2和CHA联合用药与单独药物相比,更具有预防大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌生物被膜的形成能力,细菌和真菌生物被膜的生物量显著降低;抗菌肽和CHA联合用药还可以抑制成熟生物被膜的增殖,对已形成的生物被膜的代谢有抑制作用。与单独药物处理相比,HPRP-A2和CHA联合用药对生物被膜形成的抑制作用更强。大鼠和小鼠生物被膜阴道炎模型研究证实,无论低剂量组和高剂量组,HPRP-A2和CHA的联合用药比单独用药对由大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的生物被膜引起的阴道炎中细菌和真菌抑制率更高,在高剂量组抑菌率高达99.9%（P<0.001）,治疗效果非常明显。4.HPRP-A1/HPRP-A2和CHA联合用药抗细菌和真菌的生物被膜的机理研究用激光共聚焦显微镜、扫描电镜、原子力显微镜、苯酚-硫酸法和q-PCR等技术对抗菌肽和CHA联合用药对细菌和真菌生物被膜作用机理进行了研究。结果显示:单独的抗菌肽比CHA在相同的时间和浓度下能快速的破膜。抗菌肽和CHA联合用药组比单独用药组对生物被膜细胞的完整性、生物被膜降低率的影响更为明显,更能快速破坏细菌膜的完整性,且荧光通透性增加,生物被膜的生物量降低。HPRP-A2和CHA联合用药对细菌和真菌生物被膜形态学变化比单独用药明显减少,生物被膜的面积和生物量由开始难以区分密集聚集体存在、到松散或没有明显聚集、最终使细胞膜变形、褶皱甚至损坏。HPRP-A2和CHA联合用药对生物被膜中主要成分EPS生物量明显减少,与激光共聚焦显微镜检测结果和苯酚-硫酸法结果趋势相一致。金黄色葡萄球菌中抑制细胞粘附因子表达上调和生物被膜关键调节因子的表达下调。联合用药对细菌和真菌的生物被膜有快速破膜的作用,能抑制生物被膜的EPS生物量,在调节抑制粘附因子和重要的调节因子中发挥了抑制生物被膜的作用。综上所述,本论文主要以α-螺旋阳离子抗菌肽HPRP-A1/HPRP-A2和CHA为研究对象,利用联合用药的协同浓度在体内和体外对细菌和真菌及相应的生物被膜活性和机理的研究,都可以有很好的抗细菌、抗真菌及抗生物被膜活性和靶向性。这种联合用药策略为临床用药提供有价值的理论支持,可能是今后在临床实践中治疗妇科阴道炎的有效的方法。