研究背景近年来的研究表明,炎症与多种神经退行性疾病的发生和发展密切相关。小胶质细胞属于脑固有免疫细胞,一旦被激活,通过释放致炎因子和活性氧自由基等分子介导神经炎症。在炎症发展的过程中,活化的小胶质细胞合成、释放多种免疫因子和细胞毒性因子,协同作用于周边胶质细胞和神经元,形成神经炎症-胶质细胞激活反馈系统,逐步放大彼此毒性,促成了慢性炎症的形成和炎性因子水平的持续升高,最终导致神经元的损伤变性甚至死亡。肝素具有抗凝、抗炎、抗过敏作用。对疾病模型的研究发现,肝素可以减轻脑缺血再灌注损伤等多种疾病模型的体内炎症反应。超低分子量肝素是肝素降解得到的寡糖片段,平均分子量为2.2kDa,与肝素相比,有较好的血脑屏障透过能力。另外,超低分子量肝素导致出血副作用的发生率较低,安全系数较高,对神经退行性病变具有潜在的治疗学价值。本课题研究超低分子量肝素对神经小胶质细胞炎症反应的影响及作用机制。实验方法抗炎作用研究：本课题以脂多糖刺激小鼠BV2小胶质细胞建立小胶质细胞炎症反应模型,MTT法评价超低分子量肝素(ULMWH)对BV2细胞活力的影响；采用硝酸还原酶法检测ULMWH对上清中NO释放的影响；ELISA法检测ULMWH对上清中炎症因子IL-1β、TNF-α释放的影响；Real-time PCR法检测ULMWH对IL-1β、TNF-α和ICAM-1mRNA表达的影响；Western blotting法检测ULMWH对iNOS等相关蛋白表达水平的影响；分别用流式细胞术和荧光显微镜观察方法检测ULMWH对细胞内ROS水平的影响。抗炎作用机制研究：细胞免疫荧光法观察ULMWH对BV2小胶质细胞中NFκB p65亚基核转位情况的影响；Western blotting法检测ULMWH对BV2小胶质细胞中PI3K/Akt/NFκB信号通路相关蛋白(p-Akt, Akt, p-NFκB,NFκB)及MAPKs信号通路相关蛋白(p-JNK/JNK, p-ERK/ERK, p-p38/p38)表达水平的影响。实验结果抗炎作用研究：MTT实验结果显示,ULMWH对BV2细胞没有细胞毒作用。硝酸还原酶法结果显示,50μg/mL的ULMWH可显著降低上清中NO的释放量。ELISA实验结果显示,25μg/mL、50μg/mL的ULMWH均可显著降低上清中TNF-α的释放量。Rea-time PCR结果显示,25μg/mL、50μg/mL的ULMWH均可显著降低BV2细胞中IL-1p和ICAM-1mRNA的表达,仅有50μg/mL的ULMWH可显著降低BV2细胞中TNF-αmRNA的表达。利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测,荧光显微镜观察发现,模型组细胞内绿色荧光显著增强,反映ROS水平显著提高；25μg/mL.50μg/mL的ULMWH均能明显降低细胞内荧光强度,表明ROS水平显著下降。BV2细胞孵育荧光探针DCFH-DA标记,流式细胞仪检测与上述结果一致。Western blotting结果显示与NO和PGs、ROS生成相关的iNOS、COX-2蛋白表达量明显下降。与模型组相比,25μg/mL、50μg/mL ULMWH处理组iNOS蛋白表达量分别下降了22.22%和24.44%; COX-2蛋白表达量分别下降了25.50%和38.64%。抗炎作用机制研究：细胞免疫荧光法观察p65核转位情况,结果显示,50μg/mL ULMWH组红色荧光标记的p65蛋白亚基与蓝色荧光标记的细胞核明显分离,反映LPS诱导的p65亚基的核转移情况有所改善,p65亚基转移入核量降低。Western blotting结果显示,与模型组相比,25μg/mL、50μg/mL ULMWH处理组p-Akt、NFκB表达量降低,而p-NFκB表达量升高；反映ULMWH抑制了Akt的磷酸化和p-NFκB的脱磷酸转移入核。Western blotting结果显示,与模型组相比,25μg/mL、50μg/mL ULMWH处理组p-JNK、p-ERK、p-p38表达量均降低,而JNK、ERK、p38的表达量基本不变；反映ULMWH抑制了MAPKs细胞通路中JNK、ERK、p38三条通路的蛋白磷酸化。结论超低分子量肝素(ULMWH)具有较强的体外抗BV2小胶质细胞炎症反应的活性。通过抑制Akt的磷酸化,进而抑制p-NFκB的脱磷酸转移入核以及MAPKs细胞通路中关键蛋白的磷酸化,降低COX-2. iNOS等相关酶蛋白的表达,下调TNF-α、IL-1β和ICAM-1mRNA表达,最终降低NO、ROS等炎症介质的释放水平,从而阻止LPS诱导的BV2细胞炎症反应和氧化应激进程,对神经细胞起到保护作用。ULMWH的抗炎作用对中枢神经退行性疾病具有潜在的治疗学意义。