研究背景:充血性心力衰竭(以下简称心衰)是扩张型心肌病(DCM)、冠心病、风湿性心脏病、高血压心脏病等多种心血管疾病发展的共同终末阶段,对人类生命构成巨大威胁,已成为全球范围内造成死亡的主要原因之一。心衰的发病过程非常复杂,已知的心衰发生机制主要有心肌损害、血流动力学异常和心肌重构等。一项长达10年的临床研究表明,尽管针对心衰发病的上述机制采取了许多积极的治疗措施,但心衰病人的预后并没有明显的改善,其存活率与10年前基本相同。这一结果说明,基于目前对心衰的认识真正降低心衰的患病率和死亡率非常困难,提示在心衰发生发展过程中还有许多未知因素的存在。进一步探讨这些未知因素,对从根本上预防和治疗心衰将具有重要的理论与实践意义。近年来,神经调节机制在心力衰竭中的作用得到越来越多的认可。研究者认为,当心肌受损时,心功能下降,心脏泵血不能满足机体需要,此时交感神经的兴奋性增强,其末梢释放的去甲肾上腺素作用于心肌,起正性的变时、变力、变传导作用,从而增加心脏做功。然而持续的交感神经系统活性过度增高,可使心肌的耗氧量增加,心肌过度疲劳,形成恶性循环而最终导致心力衰竭。因此,在心肌受损时阻止交感神经的过度兴奋将是改善心力衰竭的重要举措,但是目前关于交感神经兴奋过度的发生机制知之甚少。交感神经的低级级中枢位于脊髓胸段全长及腰髓1～3节段灰质中间外侧柱。随着神经解剖学研究发展,科学家发现脊髓灰质中间外侧柱(IML)神经元直接接受下丘脑室旁核神经元纤维的投射,心衰发生时,此区域神经元活动的改变可明显影响外周交感神经活动。这一发现给心衰的研究提供了新思路,许多学者对心衰神经调节机制的研究开始转向中枢神经系统。下丘脑室旁核(PVN)是重要的心血管调节中枢。研究证实,心衰时众多参与心血管活动调节的活性物质在该区域积聚。Francis等人发现,心衰时肿瘤坏死因子-α(TNF-α)不但在循环系统和心肌组织中表达增加,而且在下丘脑室旁核区域含量增加。对于TNF-α在中枢水平升高的机制有两种解释:一种是外周产生后通过下丘脑终板血管器等血脑屏障不完整的部位进入中枢;另一种是中枢小胶质细胞活化后可产生TNF-α。Francis等还证实,炎性细胞因子(pro-inflammatory cytokines, PIC)增加与神经系统之间存在一定的联系。Zhang等人观察到向正常大鼠PVN注射TNF-α可引起交感神经兴奋增强。然而,中枢TNF-α引起心衰时交感神经兴奋的具体调控机制尚不十分清楚。Kang等人发现,心衰大鼠下丘脑室旁核的Fra-LI(中枢神经元慢性激活状态的标记物)和促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)免疫双标阳性神经元数量明显增加,CRH释放增多,外周交感神经活动增强,心功能不断恶化;而且众多参与心血管活动调节的活性物质在该区域积聚,提示室旁核CRH神经元的激活与心衰的发生发展密切相关。另外,有学者发现,室旁核的部分CRH神经元纤维可投射到脊髓灰质中间外侧柱(IML)增加交感神经活动,因此推测CRH的增多及由此引起的下丘脑-垂体-肾上腺皮质(HPA)轴的激活可能是加重心衰的一个因素。本实验室曾用HPA轴缺陷的Lewis大鼠和HPA轴敏感的Fischer大鼠进行对比实验,发现心肌缺血后Lewis大鼠的心功能明显好于Fischer大鼠,交感神经兴奋性明显下降,一般生存状态也较好,4周生存率明显提高。很多年前人们就已经发现神经内分泌系统和免疫系统之间存在有密切关系。神经内分泌激素对免疫器官的发育、免疫细胞的成熟和免疫应答的调节具有广泛的作用;免疫应答过程中所产生的细胞因子等物质对神经内分泌系统也有重要影响。据此我们推测:心衰大鼠下丘脑室旁核内升高的TNF-α可能通过激活CRH神经元进而引起交感神经兴奋性增强,参与心衰的发生发展。目的:1.观察心衰大鼠下丘脑室旁核中TNF-α表达情况,以及TNF-α与交感神经活动的关系。2.观察心衰大鼠下丘脑室旁核TNF-α对CRH的影响,以及与交感神经兴奋性改变之间的关系,以阐明中枢TNF-α是否通过HPA轴来影响交感神经兴奋。方法:成年雄性Sprague-Dawley大鼠72只,体重(250±50)g,山西医科大学实验动物中心提供。大鼠进行侧脑室插管置入术后恢复一周,随机分六组(每组12只):Sham组、Sham+PTX组、Sham+αh-CRH组、HF组、HF+PTX组、HF+αh-CRH组。其中,HF组经开胸手术结扎左冠状动脉前降支建立心衰模型,Sham组大鼠左冠状动脉前降支下穿线但不结扎。开胸手术后每只大鼠都连接微型渗透泵,按照分组分别给予己酮可可碱(pentoxifylline, PTX, 10μg/h)、α螺旋促肾上腺皮质激素释放激素(αh-CRH, 15μg/h)干预,对照组给予人工脑脊液。四周后,采用Mallory氏三色染色法确定心肌梗死面积;通过血流动力学测量、右心室/体重比、肺/体重比测量来反应各组大鼠心功能;肾交感神经活动记录及血浆去甲肾上腺素检测可明确各组大鼠交感神经活动情况;测定下丘脑室旁核TNF-α和CRH变化并与交感神经活动情况作对比,从而研究中枢TNF-α和CRH变化对交感神经的影响;测定血浆白介素1β(IL-1β)水平以明确中枢给药对外周炎性细胞因子的影响。结果:1.PTX干预对各组大鼠下丘脑室旁核TNF-α表达的影响手术对照组与伪手术组相比,下丘脑室旁核TNF-α阳性细胞显著增多(见图5),Western blot证实TNF-α蛋白含量明显升高(见图5)。PTX是一种磷酸二酯酶抑制剂,可抑制TNF-α的生成。手术组大鼠侧脑室给予PTX后,可明显降低其下丘脑室旁核区域TNF-α表达。PTX对Sham组间TNF-α表达影响无统计学差异。2.PTX干预对各组大鼠下丘脑室旁核CRH水平的影响促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)是下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(HPA轴)的主要组分。在HF+VEH组,下丘脑室旁核(PVN)中CRH阳性神经元数量明显增加(见图6),Western blot结果显示CRH蛋白水平明显升高(见图6)。心衰组大鼠侧脑室给予PTX干预后,CRH阳性神经元数量下降,CRH蛋白水平降低。3.药物干预对各组大鼠血浆去甲肾上腺素水平和炎性细胞因子水平的影响外周血中去甲肾上腺素(NE)水平可以反应交感神经兴奋程度。HF大鼠交感神经过度激活,交感神经末梢释放NE增多,使血中NE水平明显升高,与Sham组相比差异有统计学意义(见表3)。经PTX干预后,减弱了中枢对交感神经的兴奋作用,所以血中NE水平下降,αh-CRH竞争抑制了CRH对HPA轴的激动作用,消除了HPA轴对交感神经的作用,血中NE水平下降。侧脑室药物干预对外周血中炎性细胞因子水平没有影响。4.药物干预对各组大鼠肾交感神经兴奋性的影响交感神经电活动记录显示HF组肾交感神经兴奋性明显增高,与伪手术组相比差异有统计学意义(见图7)。PTX和αh-CRH均可使HF大鼠肾交感神经活动减弱,但对Sham组大鼠交感神经活动影响不大。5.药物干预对各组大鼠血流动力学及右心室/体重、肺/体重比的影响心衰大鼠由于代偿作用和肺淤血,使得右心室/体重比、肺/体重比都明显增加。左室功能受损,使得LVEDP明显升高,LV +dp/dtmax及LV -dp/dtmax均明显降低,与Sham组相比差异有统计学意义(见表2)。经PTX或αh-CRH干预后,心衰大鼠各种心衰症状有所缓解,右心室/体重比、肺/体重比均降低,LVEDP也明显降低,LV +dp/dtmax及LV- dp/dtmax水平有所升高,与HF组相比差异有统计学意义(见表1)。结论:1.心力衰竭大鼠下丘脑室旁核TNF-α水平升高,外周交感神经活动增强,中枢给予PTX干预可降低交感神经活动。说明中枢TNF-α通过影响交感神经活动参与心力衰竭的发生发展。2.心力衰竭大鼠中枢CRH水平升高,交感神经兴奋性增强;侧脑室给予αh-CRH竞争抑制CRH作用可降低交感神经兴奋性,改善心功能。提示HPA轴在心力衰竭时被激活,并通过影响交感神经活动参与心力衰竭的发生发展。3.心力衰竭大鼠中枢给予PTX干预可使其PVN区域TNF-α和CRH水平都降低,并使交感神经兴奋性减弱,心功能改善。提示中枢TNF-α通过HPA轴来影响交感神经的活动。