研究背景、目的及意义：共价闭合环状DNA (covalently closed circular DNA, cccDNA)是乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)的复制模板,长期稳定的以微染色体的形式存在于受感染的肝细胞核内,虽其含量远低于HBV存在的一般形式松弛环状DNA(relaxed circular DNA, rcDNA),但对HBV的复制和感染状态的建立具有举足轻重的意义。cccDNA是HBV感染状态的持续、停用抗病毒药物后病情反复及药物耐药的关键因素,因此只有清除或有效降低细胞核内的cccDNA,才能彻底消除乙肝患者病毒携带状态,或使病情趋于稳定。cccDNA的定量检测对于理解HBV的复制和清除,评估抗病毒药物的疗效和疗程等具有重要的意义；但rcDNA或双链线性DNA (double strand DNA, dsDNA)的非特异性扩增仍然是目前要面临的主要问题。检测方法不成熟和肝组织来源困难在一定程度上阻碍了对乙肝患者cccDNA的直接研究。在鸭乙型肝炎病毒(Duck hepatitis B virus, DHBV)感染的鸭肝细胞,胞核内病毒DNA主要是以cccDNA为主,而胞浆内作为cccDNA前体的rcDNA可能有其量的10倍。因此定量检测核内病毒DNA可较直接反映cccDNA的水平。本研究将在单个肝细胞核的层面上定量检测慢性DHBV感染状态下核内病毒DNA水平及其影响因素；通过恩替卡韦短期抑制病毒复制,观察血清DHBVDNA阴转时及阴转后单个肝细胞核内病毒水平及受感染肝细胞核数的动态变化。我们的研究首次提出了在单个肝细胞核的水平上分析核内病毒DNA,并通过恩替卡韦抑制病毒复制观察核内病毒DNA的清除动力学。完成这一研究会帮助我们更加深入理解嗜肝DNA病毒的生活周期,病毒与宿主细胞间的相互作用,药物作用下单个核内病毒DNA的清除规律,同时也将为下一步研究慢乙肝患者核内HBV DNA水平及抗病毒疗效评估等奠定基础。研究方法：第一部分：建立鸭乙型肝炎病毒后天感染模型筛选1和58日龄广东樱桃谷鸭各20只,在2日及2月龄时病毒阴性动物静脉接种含1×108DHBV DNA病毒颗粒的血清。接种后不同时间点采血,抽提DNA,PCR定性及定量检测外周血病毒DNA水平。第二部分：慢性感染状态下单个肝细胞核内DHBV DNA水平1.对纳入的11只45日龄慢性DHBV感染鸭行肝活检手术2.建立单个核内DHBV DNA定量检测方法采用Taqman探针荧光定量PCR法检测单个核内DHBV DNA水平,并验证该方法的敏感性、特异性及批间差异：已知浓度的标准质粒(PBS-DHBV1.2)倍比稀释为1、10、100、1000和2、20、200、2000copies/μl。按照50μl的反应体系分别向反应孔内加入1、10、100、1000和2、20、200、2000拷贝数的PBS-DHBV1.2质粒进行real-time PCR定量扩增,得到扩增曲线和标准曲线,确定方法的敏感性(最低检测下限)；分别用含有DHBV、HBV及HCV全基因组的质粒进行扩增,验证引物和探针的特异性；分四批定量检测两只动物单个核内DHBV DNA水平,计算核内病毒拷贝数的批间差异,用变异系数(CV%)表示。3.匀浆研磨5mg肝组织、低速离心、匀浆液充分洗涤得到肝细胞核悬液、通过流式细胞仪分选得到单个细胞核；单个细胞核经蛋白酶K消化、EcoRI酶切后,采用荧光定量PCR法检测核内病毒DNA水平。4.流式细胞仪分选105个肝细胞核至1ml的PBS溶液中、提取总的核内DNA,采用荧光定量PCR法检测总的核内病毒DNA水平。5.细胞周期检测并分选处在不同周期的单个核500μ1的肝细胞核悬液(约1×105个核)中加入15μl PI(100μg/ml)染色液,避光室温孵育至少30min;流式细胞仪将根据核内DNA的量确定细胞周期的分布状况,并分选处在不同细胞周期的单个核至96孔板中。6.明确整合的病毒DNA影响质粒安全ATP依赖的DNA酶(PSAD)可以选择性消化线性DNA(即整合的片段),对cccDNA和rcDNA无影响。单个核内病毒DNA在1个单位PSAD酶的作用下37℃孵育30min,然后70℃、30min灭活该酶;再加入5个单位的EcoR I,37℃孵育30min。采用荧光定量PCR法检测单个核内病毒DNA水平,确定病毒阳性细胞核数,比较PSAD处理组与未处理组间的差异。7.病毒DNA在肝内的存在形式采用酚-氯仿抽提法提取肝细胞核、细胞质及肝细胞内的总DNA, Southern blot印迹杂交检测病毒DNA的存在形式。第三部分：恩替卡韦治疗对单个核内DHBV DNA的影响实验分组：将11只45日龄慢性DHBV感染鸭随机分两组：恩替卡韦治疗组(n=6)和未治疗组(n=5)。治疗组每只动物每日接受0.5mg恩替卡韦抗病毒,血清DHBV DNA阴转时,行第二次肝活检；阴转后继续给药治疗16周,治疗结束时处死所用动物,取出肝组织标本。观察单个核内DHBV DNA水平及受感染肝细胞核数的动态变化。统计学分析：所有数据采用SPSS16.0进行处理。计数资料组间比较采用Pearson’s chi-square检验,对理论频数小于5的四格表资料采用Fisher精确概率法。连续变量之间的相关性应用Pearson方法。计量资料若满足正态分布或方差齐性采用参数检验方法(两独立样本t检验)；计量资料若不满足正态分布及方差不齐则采用非参数检验方法(Mann-Whitney U检验)。计量资料多组间整体比较采用Kruskal-Wallis H检验。因无法观察同一个肝细胞核在不同时间点或酶处理前后的变化,因此不采用配对比较。所有统计采用双侧检验,P<0.05认为差异具有统计学意义。研究结果：第一部分：建立鸭乙型肝炎病毒后天感染模型筛选出4只58日龄和2只1日龄血清DHBV DNA阳性鸭,感染率分别为20%和10%。两组血清病毒阴性动物在2月龄或2日龄时静脉接种含1×108DHBV DNA病毒颗粒的血清。2月龄动物在接种后两个月内均未产生可检测的病毒血症,后天感染率为0,提示在成鸭中较难建立鸭乙型肝炎病毒后天感染模型。2日龄动物在接种后第14天,78.6%的动物可检出病毒血症,血清DHBV DNA水平在108copies/ml左右,随后观察的3个时间点,血清病毒载量均维持在107-109copies/ml之间。第二部分：慢性感染状态下单个肝细胞核内DHBV DNA水平成功建立单个核内DHBV DNA定量检测方法将含有DHBV、HBV和HCV全基因组质粒进行荧光定量PCR扩增,发现除了DHBV质粒能成功扩增外,其余质粒均未产生荧光信号,无假阳性扩增,提示引物和探针的特异性好。分别用1、2、10和20拷贝的PBS-DHBV1.2质粒进行荧光定量PCR扩增,发现除了1拷贝的质粒不能被有效扩增外,其余均能检出。两次独立重复试验均取得相一致结果：单个核内DHBV DNA最低定量检测下限(Low Limit of Detection, LLOD)为2拷贝。分四批定量检测两只动物单个核内DHBV DNA水平,批间变异系数(CV%)分别为2.42%和6.92%。单个核内DHBV DNA水平慢性感染状态下,不是所有肝细胞核均受感染(63.3%-93.3%)。核与核之间病毒拷贝数差异较大(2-204)。Pearson相关性分析发现,核内病毒DNA平均拷贝数(7.57-57.67)与核内总的病毒载量(r=0.927,P<0.001)和血清病毒水平(r=0.605,P=0.049)呈正相关。核内DHBV DNA水平与细胞周期有关流式细胞仪对3只45日龄动物行细胞周期检测,发现分别有75%、81%、79%的肝细胞核处在G0/1期,15%、11%、10%的核处在S期,10%、8%、11%的核处于G2/M期。细胞周期间病毒阳性核拷贝数整体比较有显著性差异(P<0.001),G0/1期最高,其次是G2/M和S期；阳性细胞核比率整体比较也有显著性差异(P<0.05),S期阳性细胞核比率最低,约一半的阳性核病毒拷贝数低于10。PSAD酶处理对核内DHBV DNA水平影响较小PSAD酶处理组与未处理组相比较,各动物病毒阳性核拷贝数均未见有显著变化：动物编号22(Z=-0.810, P=0.418),51(Z=-0.352, P=0.725),52(Z=-1.837, P=0.066),62(Z=-0.321, P=0.748),65(Z=1.041, P=0.298);各动物病毒阳性核比率也未发生统计学意义改变：动物编号22(χ2=0.098, P=0.075),51(χ2=0.351, P=0.554),52(χ2=0.741, P=0.389),62(χ2=0.480,P=0.488),65(χ2=1.071,P=0.301)。核内DHBV DNA主要是以cccDNA的形式存在Southern blot结果显示肝细胞核内DHBV DNA主要以cccDNA的形式存在,也可见有少量rcDNA;胞质中病毒DNA以rcDNA, dsDNA和ssDNA的形式存在。第三部分：恩替卡韦治疗对单个核内DHBV DNA的影响恩替卡韦治疗对病毒阳性肝细胞核比率的影响恩替卡韦抗病毒治疗能显著降低病毒阳性肝细胞核比率(P<0.001)。阳性率下降主要发生在从基线至血清病毒DNA阴转时,延长治疗过程中阳性率下降仍较明显。从基线至血清病毒DNA阴转时,恩替卡韦治疗组动物阳性肝细胞核比率明显降低(86.1%vs.50.6%,x2=52.580,P<0.001)；未治疗组阳性率未发生有统计学意义改变(70.0%vs.83.3%；x2=2.981,P=0.080)。从血清病毒DNA阴转至治疗结束,恩替卡韦治疗组动物阳性肝细胞核比率明显降低(48.3%vs.25.8%；x2=13.019,P=0.001)；未治疗组阳性率未发生有统计学意义改变(83.3%vs.86.7%；x2=1.310,P=0.718)。恩替卡韦治疗对单个核内DHBV DNA水平的影响血清病毒DNA阴转时,恩替卡韦治疗组动物病毒阳性核拷贝数明显低于基线时水平(Z=-7.984,P=0.000)；未治疗组病毒阳性核拷贝数未发生统计学意义改变(t=0.313,P=0.755)。对每只动物进行分析,发现治疗组中除了9号(Z=-1.745,P=0.081),52号(t=1.479,P=0.148)动物病毒阳性核拷贝数无明显变化外,其余均明显降低。从血清病毒DNA阴转至治疗结束,核内病毒DNA平均拷贝数缓慢降低,但个别核内病毒水平仍较高。结论：1.本研究成功建立单个核内DHBV DNA定量检测方法,该方法具有较理想的敏感性及特异性。2.慢性感染状态下单个核内DHBV DNA拷贝数相差较大,核内DHBV DNA平均拷贝数与血清病毒水平及核内总的病毒载量正相关。3.单个核内DHBV DNA水平与细胞周期状态有关。病毒在G0/1期复制活跃,其次是G2/M和S期。4.抗病毒治疗能有效降低单个核内DHBV DNA水平及受感染肝细胞核数量。