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目的：前列腺癌(Prostate cancer,Pca)是欧美国家最常见的恶性肿瘤,我国的男性前列腺癌发病率近年来呈上升趋势。去势抵抗性前列腺癌通常可采用紫杉醇等化疗,但最终也会引起紫杉醇耐药而导致治疗失败。因此,临床前列腺癌治疗急需找到激素抵抗性和耐药的前列腺癌新的治疗靶点。本文研究S期激酶相关蛋白(S-Phase Kinase-Associated Protein 2,Skp2)及其抑制剂对人前列腺癌紫杉醇耐药细胞PC-3-Txr和DU145-TxR增殖和活力的影响,为前列腺癌的临床治疗提供新的理论依据。方法：1 应用MTS的方法检测本实验室已构建的雄激素抵抗紫杉醇耐药细胞PC-3-TxR和DU145-TxR的耐药指数。2应用实时荧光定量RT-PCR和Western blot的方法检测Skp2、Fbxw8、CUL1-7等Cullin-Ring E3连接酶亚单位在前列腺癌亲本细胞和紫杉醇耐药细胞的表达。3慢病毒介导Skp2ShRNA干扰PC-3-TxR和DU145-TxR细胞Skp2的表达。应用实时荧光定量RT-PCR和Western blot方法检测Skp2干扰效率。4应用MTS的方法检测Skp2干扰以及Skp2抑制剂联合化疗药物紫杉醇对前列腺癌耐药细胞增殖作用的影响。5利用Western blot方法检测Skp2的底物例如p21,p27和FOX01在前列腺癌亲本细胞和紫杉醇耐药细胞的表达。6应用实时荧光定量RT-PCR和Western blot的方法检测EMT标志物E-cadherin和Vimentin mRNA和蛋白水平在前列腺癌亲本细胞和紫杉醇耐药的前列腺癌细胞的表达。进一步检测shRNA干扰Skp2表达对前列腺癌紫杉醇耐药细胞PC-3-TxR和DU145-TxR E-cadherin和Vimentin mRNA和蛋白水平表达的影响。7通过Western blot的方法检测shRNA干扰Skp2表达对前列腺癌紫杉醇耐药细胞PC-3-TxR和DU145-TxR的Skp2细胞周期相关蛋白CyclinA、CyclinB1、CyclinE2、p21、p27和FOX01表达的影响。探讨Skp2参与前列腺癌紫杉醇耐药形成的可能相关的信号通路和分子机制。8应用MTS方法检测Skp2抑制剂C1(SKPin C1)和SZL-P1-41(复合物#25)对前列腺癌亲本细胞PC-3和DU145和紫杉醇耐药细胞PC-3-TxR和DU145-TxR增殖和活力的影响。9利用Western blot方法检测Skp2抑制剂Cl(SKPin C1)和SZL-P1-41(复合物#25)联合紫杉醇作用对前列腺癌紫杉醇耐药细胞PC-3-TxR和DU145-TxR Skp2重要的底物蛋白P21、P27表达的影响。结果：通过MTS实验观察发现12.5nM紫杉醇处理48或72小时显著抑制PC-3细胞生长；而在PC-3-TxR细胞,200nM紫杉醇处理48或72小时才显著抑制细胞的生长。亲本细胞PC-3或DU145的72小时IC50分别是18.42或10.91nM。耐药细胞PC-3-TxR或DU145-TxR的72小时IC50分别是166.47或3245.63nM。Western blot方法和实时荧光定量RT-PCR的实验观察发现Skp2蛋白和mRNA在前列腺癌紫杉醇耐药细胞表达显著增加。在紫杉醇耐药的前列腺癌细胞里构建筛选稳定的干扰Skp2的细胞株PC-3-TxR Skp2shRNA和DU145-TxR Skp2shRNA。耐药细胞干扰Skp2之后增加了对紫杉醇的敏感性。Skp2抑制剂与紫杉醇联合用药的MTS结果表明,紫杉醇组与紫杉醇联合Skp2抑制剂组相比,紫杉醇联合Skp2抑制剂组的细胞增殖抑制作用更加明显,Western blotting实验观察到上皮细胞相关标志E-cadherin在耐药细胞株中显著低于亲本细胞株；间充质细胞相关标志Vimentin和Skp2在耐药细胞株中显著高于亲本细胞株。与亲本细胞株相比,耐药细胞株中Skp2的底物蛋白p27的表达降低。免疫荧光技术进一步观察EMT的标志物和Skp2的表达和定位。在紫杉醇耐药的前列腺癌细胞里敲低Skp2之后恢复了p27的表达。此外,在耐药细胞株中紫杉醇和Skp2抑制剂单独处理导致了p27的累积。重要的发现是紫杉醇联合Skp2抑制剂之后显著地增加了p27的表达。结论：研究发现Skp2在前列腺癌紫杉醇耐药细胞高表达；敲低Skp2表达能增加前列腺癌耐药细胞对紫杉醇的敏感性,逆转p27蛋白的降低。并且,Skp2抑制剂联合紫杉醇作用也能逆转前列腺癌紫杉醇耐药,其机制可能通过Skp2-p27通路实现的。