研究背景输卵管积水是由于输卵管伞端梗阻而引起的女性输卵管内异常的液体积聚。多发生在盆腔急、慢性感染后,常无明显的临床症状,偶有阴道排液。在育龄期妇女中发病率呈逐年上升趋势,是导致不孕症的常见原因。体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET)在解决输卵管性不孕中发挥了很大的作用,但大量临床研究分析显示,输卵管积水会影响IVF结局,但其确切机制尚未完全阐明。因此,探讨输卵管积水对IVF妊娠结局的影响机制,对于指导临床对输卵管积水患者作适当预处理、进一步提高IVF成功率至关重要。研究目的通过观察不同浓度输卵管积水中胚胎的生长发育情况,了解输卵管积水对胚胎是否具有毒性作用;通过对各浓度积水组扩张期囊胚的双重荧光染色,鉴定各组扩张期囊胚的质量,探讨输卵管积水对胚胎的潜在影响;通过对各组不同生长阶段囊胚培养液中生长因子IGF-Ⅱ和EGF浓度的检测,进一步讨论积水中胚胎生长或生长受限的原因。研究方法1.不同浓度积水组中胚胎的培养和观察收集2009年6月至2009年12月在我院生殖中心常规进行IVF-ET/ICSI-ET治疗的新鲜废弃胚胎,随机分入含有积水浓度分别为0%,20%,40%,60%,80%,100%的囊胚培养液,培养至D5~D8,每天同一时间观察胚胎的发育情况并记录。比较不同浓度积水组D5早期囊胚形成数、D6囊胚扩张数、D7囊胚孵出数及各组囊胚形成总数、扩张总数、孵出总数,了解不同浓度积水对囊胚发育速度及对各期囊胚发育情况的影响。2.差异性染色法鉴定各组扩张期囊胚质量用两种荧光染料Bisbenzimide (Hoechst33342)和碘化丙啶(Propidium iodide , PI),对0%~80%积水组扩张期囊胚进行染色并在荧光显微镜下拍照。分别对内细胞团细胞和滋养层细胞计数,比较各组囊胚ICM细胞数和ICM/Total比值,从而鉴定囊胚质量。3.酶联免疫吸附实验测定培养液中IGF-Ⅱ和EGF的浓度用酶联免疫吸附实验测定含不同浓度积水的胚胎培养液、各组囊胚扩张期、孵出期培养液中IGF-Ⅱ和EGF的浓度,酶标仪450 nm处记录数值,每组3个复孔。4.统计学分析采用SPSSl7.0 for Windows软件包进行统计分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,多组之间比较采用方差分析。P<0.05为差异具有统计学意义。结果1.0%~80%浓度输卵管积水中,D5早期囊胚形成数、D6囊胚扩张数、D7囊胚孵出数,均无统计学差异(P>0.05);100%浓度输卵管积水中,上述观察指标较0%~80%组均明显减少,结果具有统计学差异(P<0.05)。0%~80%浓度输卵管积水中,观察期间(D5~D8)囊胚形成总数、囊胚扩张总数、囊胚孵出总数均无统计学差异(P>0.05);100%浓度输卵管积水中,上述观察指标较0%~80%组均明显减少,结果具有统计学差异(P<0.05)。2.0%~60%浓度积水组囊胚细胞总数及ICM/Total比值比较无统计学差异(P>0.05);80%浓度积水组细胞总数较前四组减少,但是ICM/Total比值与前四组比较无统计学差异(P<0.05)。3.含不同浓度输卵管积水的囊胚培养液中所含的IGF-Ⅱ和EGF基础浓度,0%~40%积水组与60%~80%积水组、100%积水组,60%~80%积水组与100%积水组之间比较,结果有统计学差异(P<0.05);在囊胚扩张期,0%~60%积水组与80%积水组、100%积水组,80%与100%积水组之间,两种因子的浓度比较,结果有统计学差异(P<0.05);在孵出期,0%~80%积水组与100%积水组之间,两因子浓度比较有统计学差异(P<0.05)。结论1.低、中浓度(20%~60%)输卵管积水对胚胎没有毒性作用,不影响胚胎的发育潜能;较高浓度(80%)输卵管积水使囊胚的细胞数减少;高浓度(100%)输卵管积水影响胚胎的发育。2.输卵管积水中含有一定浓度的生长因子,如IGF-Ⅱ、EGF,其浓度随积水浓度的升高而降低。20%~80%浓度积水中,胚胎通过其自分泌作用可以增加IGF-Ⅱ和EGF,使胚胎继续发育;而100%浓度积水中,胚胎自分泌作用增加的IGF-Ⅱ和EGF仍不能满足胚胎继续生长发育的需要。3.胚胎的形态学观察不一定完全反映胚胎的发育情况,也不一定能够准确预测胚胎的发育潜能。胚胎培养液中生长因子的浓度,与囊胚形成率、孵出率有相关性,可以作为胚胎质量及发育潜能的评估指标。4.在输卵管积水对人类胚胎发育是否有影响的研究中,不能用动物实验替代,人类胚胎实验与动物胚胎实验所得出的结论可能完全不同。