论文部分内容阅读
目前肿瘤一直是导致人类死亡的主要原因之一,其发病率呈逐年上升的趋势。放射治疗作为肿瘤的三大主要治疗手段(放疗、化疗、外科手术)之一有着不可替代的重要地位。人们发现射线之所以能够杀死肿瘤细胞主要在于它能够损伤肿瘤细胞的DNA分子,引起DNA分子双链断裂,导致细胞失活和染色体畸变,最终使细胞凋亡。目前人们越来越关注肿瘤细胞DNA的变化与其凋亡的关系,获得了有关肿瘤细胞核DNA(nDNA)改变的许多知识,但对肿瘤细胞线粒体DNA(mtDNA)的研究相对较少。很多报道发现mtDNA与肿瘤之间存在着密切的关系,无论是肿瘤细胞的发生、发展,还是肿瘤细胞的死亡都和mtDNA密切相关。过去的文献大多报道机体遭辐照后nDNA的损伤情况,对mtDNA的损伤研究较少。目前有文献报道高线性能量传递(Liner energy transmission,LET)射线引起的核DNA双链断裂是非随机分布的,而低线性能量传递射线中X射线引起的核DNA双链断裂位点是随机分布的,我们希望通过本试验研究了解肿瘤细胞经辐照后其mtDNA与nDNA损伤的具体情况,检测在肿瘤细胞mtDNA与nDNA上是否存在对射线敏感的位点,这些位点的分布是否随机,并对mtDNA和nDNA经射线照射后的受损情况作出比较,希望能为肿瘤的临床治疗提供一定的指导,并对细胞的辐射敏感性研究提供一个新的参考指标。国内目前在临床上放疗使用的主要还是低LET射线,即γ和X射线。本实验对肿瘤细胞照射不同剂量的γ和X射线,对其mtDNA和nDNA的断裂敏感位点的分布进行检测,并作出mtDNA和nDNA的损伤程度比较,同时对mtDNA的编码区和D-loop区、重链和轻链,nDNA的两条链之间的断裂损伤情况作了比较。射线引起细胞DNA断裂的途径有直接损伤和间接损伤。直接损伤是射线直接作用于DNA分子引起DNA断裂;间接损伤主要是由射线照射导致细胞内的水分子发生电离,产生氧自由基(主要是·OH),这些自由基再和生物大分子发生作用,导致不可逆损伤。两种效应有同等的重要性。本实验选取人肝癌细胞SMMC-7721细胞作为研究对象,对其采用由小到大的辐射剂量照射,用10Gy、20Gy、30Gy、50Gy四种不同剂量的γ和X射线来照射细胞,并测定了细胞存活度,检测其mtDNA和nDNA的断裂状况。由于mtDNA是多拷贝的,一个线粒体含有2到10个mtDNA[3],1个细胞含有几百到几千个线粒体,要比较mtDNA和nDNA的损伤程度需测定mtDNA的相对拷贝数,我们建立了用PCR检测细胞mtDNA拷贝数的方法。我们在辐照细胞后即刻提取对照组和各实验组细胞的基因组DNA,然后用接头介导PCR(LM-PCR)方法进行检测,并结合碱性凝胶电泳实验观察其大致损伤程度,再通过基因扫描得出其具体损伤位点和频率。结果显示:①在SMMC-7721细胞mtDNA与nDNA中确实存在着对射线敏感的断裂位点,断裂损伤频率随辐射剂量的增加呈上升趋势,并随剂量增加出现了新的断裂位点;②mtDNA与nDNA对γ射线敏感的断裂位点和对X射线敏感的断裂位点位置均相同;③射线照射后SMMC-7721细胞mtDNA的损伤程度要高于nDNA;④mtDNA的重链损伤程度高于轻链,编码区(选取细胞色素b基因作为研究对象)的损伤程度要高于D-loop区;⑤nDNA(选取18SrRNA基因作为研究对象)的模板链的损伤程度高于编码链,这种结果很可能与蛋白保护或DNA的空间结构有一定的关系;⑥从碱基组成来看,胸腺嘧啶(T)和鸟嘌呤(G)的损伤占到损伤碱基的82%,推测这两种碱基是·OH的主要攻击对象,这也从侧面说明了辐照对DNA的损伤是以间接损伤为主。mtDNA损伤重于nDNA,mtDNA编码区损伤重于D-loop区的的主要原因可能是nDNA和mtDNA D-loop区受蛋白保护所致。nDNA模板链损伤程度重于编码链,mtDNA重链的损伤程度重于轻链的主要原因可能是由于模板链和重链在转录时暴露较多,更易受辐射损伤之故。