目的:非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD）是指除外酒精和其他明确的损肝因素所致的,以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变为主要特征的临床病理综合征,包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis, NASH）和脂肪性肝硬化。在我国,NAFLD已成为慢性肝病的常见类型。非酒精性脂肪性肝纤维化作为NAFLD发病的中间阶段,其具体发生机制尚未完全阐明。脂联素是脂肪细胞分泌的一种保护性脂肪因子,可通过活化腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase, AMPK）和激活p38有丝分裂原活化蛋白激酶,发挥抗炎、改善胰岛素抵抗、促进脂肪酸氧化等作用。目前研究显示,脂联素具有抗纤维化作用,能够抑制肝星状细胞（hepatic stellate cell, HSC）活化、增殖、迁移,促进活化HSC凋亡,但其具体机制不明。一氧化氮合酶（nitric oxide synthase, NOS）是合成一氧化氮的限速酶,脂联素能增强内皮型NOS（endothelial nitric oxide synthase, eNOS）的活性,抑制血管内皮细胞收缩。但脂联素能否通过调节NOS表达抑制HSC活化尚不得知。辛伐他汀是临床常用的降血脂药物,随着研究深入,其非降脂作用日益受到重视,如抗炎、抗氧化、抑制细胞增殖等。研究显示,辛伐他汀能降低NAFLD患者的血脂水平,减轻肝组织脂肪变性程度,但其能否提高NAFLD患者血清脂联素水平、上调肝组织脂联素表达、抑制或延缓肝纤维化进展仍有争议。因此,本研究应用高脂饮食建立非酒精性脂肪性肝纤维化大鼠模型,通过检测血清脂联素水平,肝组织脂联素、AMPK mRNA和蛋白含量,观察模型大鼠中脂联素、AMPK和NOS的表达变化及意义;体外培养HSC,明确外源性脂联素对HSC中AMPK、NOS表达的影响;并通过体内外实验观察辛伐他汀对模型大鼠肝组织及体外培养HSC中脂联素、NOS表达的影响,从整体、组织、细胞及分子水平探讨辛伐他汀对非酒精性脂肪性肝纤维化的可能作用机制,为临床有效防治非酒精性脂肪性肝纤维化提供新的理论依据及治疗靶点。方法:1脂联素在非酒精性脂肪性肝纤维化大鼠肝脏中的表达及意义健康雄性清洁级Wistar大鼠40只,体重（150±10）g,由河北医科大学动物实验中心提供。正常喂养1周后随即分为正常对照组和模型组,其中正常对照组大鼠10只,以标准饲料喂养,模型组大鼠30只,以高脂饮食喂养（标准饲料基础上加2%胆固醇、10%猪油和5%玉米油）。分别于第8、12、16、20、24周末隔夜空腹处死模型组大鼠各6只,迅速采血并留取肝组织标本。应用全自动生化分析仪测定血清丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase, ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase, AST）、胆固醇（cholesterol, TC）和甘油三酯（triglyceride, TG）水平;酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）法检测血清脂联素水平;取部分新鲜肝组织立即冰冻切片,进行苏丹IV染色以观察肝组织脂肪变性情况;另取部分肝组织以10%福尔马林固定并制作石蜡切片,分别行苏木素-伊红（hematoxylin-eosin staining, HE）染色和Masson三重染色,以观察肝组织普通病理改变及纤维化程度;余肝组织-80℃保存,用逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）检测脂联素、AMPK、?型胶原mRNA的表达,用蛋白印记法（ Western Blot ）测定脂联素、AMPK、磷酸化AMPK（phosphorylated AMPK, p-AMPK）、?型胶原蛋白的表达变化。2脂联素抑制肝星状细胞活化的分子机制人肝星状细胞株LX-2细胞购自中科院细胞库。将处于对数生长期的LX-2细胞接种在六孔板中,每孔5×10⁵个细胞,用含10%胎牛血清和1%青链霉素的高糖DMEM培养至70%融合时换用促进脂肪细胞分化的培养基（adipogenic differentiation mixture, ADM,含10%胎牛血清、1%青链霉素、0.5 mM异丁基甲基黄嘌呤、1μM地塞米松和1μM胰岛素的低糖DMEM）培养72 h,获得静止型LX-2细胞,用含0.2%胎牛血清的DMEM培养24 h,使细胞同步化。对照组常规培养并加入溶剂,处理组在常规培养基础上分别加入TGF-β1（100 pM）、脂联素（5μg/ml）、TGF-β1（100 pM）+脂联素（5μg/ml）、NOS抑制剂L-NAME（100μM）、L-NAME（100μM）+脂联素（5μg/ml）处理1 h（用于检测AMPK表达情况）或24 h,收取细胞。RT-PCR和Western Blot法分别检测各组LX-2细胞中AMPK、诱导型NOS（inducible nitric oxide synthase, iNOS）、eNOS、α平滑肌动蛋白（smooth muscle actin,α-SMA）和?型胶原mRNA和蛋白的表达。3辛伐他汀对非酒精性脂肪性肝纤维化的治疗作用及其机制体内实验:健康雄性清洁级Wistar大鼠18只,体重（150±10）g,由河北医科大学动物实验中心提供。正常喂养1周后随即分为正常对照组6只,以标准饲料喂养,模型组12只,以高脂饮食喂养（标准饲料基础上加2%胆固醇、10%猪油和5%玉米油）。于第16周末从模型组大鼠中随机随机分出6只大鼠为辛伐他汀干预组,在高脂饮食基础上加用辛伐他汀(4mg·kg^-1·d^-1)灌胃,余大鼠采用生理盐水灌胃,均于第24周末隔夜空腹处死,留取血清及肝组织标本。应用全自动生化分析仪测定血清ALT、AST、TC、TG水平;ELISA法检测血清脂联素水平;HE染色、苏丹IV染色和Masson三重染色分别观察肝组织炎症、脂肪变性及纤维化程度;RT-PCR法和Western Blot法测定肝组织脂联素、eNOS、I型胶原mRNA和蛋白表达的变化。体外实验:LX-2细胞的准备同第二部分。LX-2细胞的对照组加入溶剂,处理组分别加入TGF-β1（100 pM）、辛伐他汀（10μM）、TGF-β1（100 pM）+辛伐他汀（10μM）、L-NAME（100μM）、L-NAME（100μM）+辛伐他汀（10μM）处理24 h,收取细胞。另准备LX-2细胞做如下实验:对照组加入溶剂,处理组加入不同浓度辛伐他汀（1μM, 2.5μM, 5μM, 10μM）处理24 h后收取细胞;或加入10μM辛伐他汀作用不同的时间（1 h, 1.5 h, 3 h, 6 h, 12 h, 24 h）,观察辛伐他汀对LX-2细胞中脂联素表达的影响。结果:1脂联素在非酒精性脂肪性肝纤维化大鼠肝脏中的表达及意义1.1模型大鼠血清生化指标和脂联素的变化:随着造模时间延长,模型组大鼠血清ALT、AST、TC、TG水平逐渐升高,脂联素水平逐渐降低,与对照组相比P<0.05或P<0.01,并且血清ALT、AST、TC、TG水平与脂联素水平负相关,相关系数分别为-0.58、-0.52、-0.55和-0.45,P值均<0.01。1.2肝组织病理学改变:模型组大鼠肝组织镜下表现为肝细胞浊肿、气球样变,伴小叶内混合性炎症细胞浸润、可见点、灶状坏死,肿胀的肝细胞出现中、重度脂肪变性,以中央静脉周围最为明显。随造模时间延长,肝细胞脂肪变性及小叶内炎症逐渐加重。第16周末,部分模型大鼠肝组织出现少量窦周纤维化,至24周末模型组大鼠均出现明显窦周纤维化,部分可见中央静脉周围和汇管区纤维化。1.3大鼠肝组织脂联素、AMPK和?型胶原mRNA和蛋白的表达变化:随造模时间延长,肝组织脂联素和AMPK的mRNA、蛋白表达逐渐减少,?型胶原mRNA和蛋白表达逐渐增加,与正常对照组比较P<0.05或P<0.01。肝组织脂联素和AMPK mRNA表达呈正相关,相关系数为0.81,P值<0.01;二者均与?型胶原mRNA表达呈负相关,相关系数分别为-0.88和-0.87,P值均<0.01。以p-AMPK/AMPK表示其活性,则AMPK活性降低。肝组织脂联素蛋白表达和AMPK活性呈正相关,相关系数为0.90,P值<0.01;二者均与型胶原蛋白表达呈负相关,相关系数分别为-0.91和-0.94,P值均<0.01。2脂联素抑制肝星状细胞活化的分子机制2.1 TGF-β1诱导静止型LX-2细胞表达α-SMA、?型胶原,减弱AMPK活性,减少eNOS表达,增加iNOS表达:经ADM处理3天后,LX-2细胞仅表达少量α-SMA和?型胶原,基本分化为静止表型。用TGF-β1处理静止型LX-2细胞,结果LX-2细胞活化并合成大量α-SMA和?型胶原,α-SMA mRNA和蛋白表达均增加（0.55±0.05 vs. 0.12±0.02;0.58±0.07 vs. 0.13±0.03,P值均<0.05）、?型胶原mRNA和蛋白表达均增加（0.46±0.10 vs. 0.09±0.02;0.43±0.07 vs. 0.08±0.03,P值均<0.05）;p-AMPK表达减少,AMPK活性减弱（用p-AMPK/AMPK表示:0.24±0.04 vs. 0.43±0.07,P<0.05）,eNOS mRNA和蛋白表达减少（0.30±0.10 vs. 0.44±0.08;0.30±0.09 vs. 0.46±0.07,P值均<0.05）,iNOS mRNA和蛋白表达增加（0.53±0.07 vs. 0.37±0.04;0.55±0.07 vs. 0.39±0.05,P值均<0.05）。2.2脂联素抑制静止型LX-2细胞活化,增强LX-2细胞中AMPK的活性,增加eNOS表达,减少iNOS表达:用脂联素处理静止型LX-2细胞,结果α-SMA和Ⅰ型胶原表达与对照组相比无统计学差异,AMPK活性增强（0.53±0.06 vs. 0.43±0.07,P<0.05）,eNOS mRNA和蛋白的表达增加（0.56±0.10 vs. 0.44±0.08;0.55±0.05 vs. 0.46±0.07,P值均<0.05）,iNOS mRNA和蛋白的表达减少（0.30±0.02 vs. 0.37±0.04;0.32±0.03 vs. 0.39±0.05,P值均<0.05）。2.3脂联素抑制由TGF-β1导致的α-SMA、Ⅰ型胶原高表达,增强AMPK活性,上调eNOS表达,下调iNOS表达:用脂联素干预经TGF-β1预处理的LX-2细胞,与TGF-β1组相比,α-SMA mRNA和蛋白表达下降（0.32±0.08 vs. 0.55±0.05;0.32±0.04 vs. 0.58±0.07,P值均<0.05）、Ⅰ型胶原mRNA和蛋白表达下降（0.29±0.05 vs. 0.46±0.10;0.32±0.04 vs. 0.43±0.07,P值均<0.05）,AMPK活性增强（0.43±0.07 vs. 0.24±0.04,P<0.05）,eNOS mRNA和蛋白的表达增加（0.43±0.08 vs. 0.30±0.10;0.42±0.07 vs. 0.30±0.09,P值均<0.05）,iNOS mRNA和蛋白的表达减少（0.44±0.05 vs. 0.53±0.07;0.46±0.07 vs.0.55±0.07,P值均<0.05）。2.4脂联素上调由L-NAME导致的eNOS低表达,抑制α-SMA和Ⅰ型胶原表达:用L-NAME处理静止型LX-2细胞,并以TGF-β1作为阳性对照,结果二者均能导致LX-2细胞高表达α-SMA和Ⅰ型胶原、低表达eNOS。与对照组相比,L-NAME组的α-SMA mRNA和蛋白表达均增加（0.41±0.04 vs. 0.12±0.02;0.40±0.07 vs. 0.13±0.03,P<0.05）,Ⅰ型胶原mRNA和蛋白表达均增加（0.38±0.06 vs. 0.09±0.02;0.38±0.05 vs. 0.08±0.03,P<0.05）,eNOS mRNA和蛋白表达均减少（0.19±0.05 vs. 0.44±0.08;0.17±0.04 vs. 0.46±0.07,P值均<0.05）,iNOS mRNA和蛋白表达亦减少（0.22±0.05 vs. 0.37±0.04;0.25±0.04 vs. 0.39±0.05,P值均<0.05）,AMPK活性无差异。脂联素能上调由L-NAME导致的eNOS低表达,与L-NAME组比较,脂联素+L-NAME组eNOS蛋白表达增加（0.31±0.05 vs. 0.17±0.04,P<0.05）,eNOS mRNA表达也增加,但无统计学意义。脂联素对L-NAME导致的iNOS低表达无影响,维持其低水平。3辛伐他汀对非酒精性脂肪性肝纤维化的治疗作用及其机制3.1模型大鼠血清生化指标和脂联素的变化:随着造模时间延长,模型组大鼠血清ALT、AST、TC、TG水平逐渐升高,脂联素水平逐渐降低,与对照组相比P<0.05或P<0.01。与模型24周组相比,辛伐他汀治疗组大鼠血清ALT、AST、TC、TG降低（P<0.05或P<0.01）,脂联素水平虽有所升高,但无统计学意义。3.2肝组织病理学改变:随造模时间延长,肝细胞脂肪变性、小叶内炎症及纤维化程度逐渐加重。造模第24周末,模型组大鼠肝组织均出现明显窦周纤维化,部分可见中央静脉周围和汇管区纤维化。辛伐他汀干预组大鼠肝组织脂肪变性、炎症及纤维程度均较模型24周组减轻。3.3大鼠肝组织脂联素、eNOS、Ⅰ型胶原mRNA和蛋白的表达变化:随造模时间延长,模型组大鼠肝组织脂联素、eNOS mRNA和蛋白表达逐渐减少,Ⅰ型胶原mRNA和蛋白表达逐渐增加,与正常对照组比较P<0.05或P<0.01。与模型24周组相比,辛伐他汀组大鼠肝组织脂联素mRNA和蛋白的表达均增加（0.34±0.04 vs. 0.27±0.05;0.36±0.05 vs. 0.24±0.06,P<0.05）,eNOS mRNA和蛋白的表达均增加（0.30±0.02 vs. 0.24±0.01;0.45±0.04 vs. 0.22±0.02,P<0.05）,Ⅰ型胶原mRNA和蛋白表达均减少（0.14±0.01 vs. 0.25±0.01;0.54±0.02 vs. 0.89±0.03,P<0.05）。模型组大鼠肝组织中eNOS mRNA和蛋白表达与Ⅰ型胶原mRNA和蛋白表达均呈负相关,相关系数分别为-0.91、-0.92、-0.92和-0.89,P值均<0.01。3.4辛伐他汀抑制静止型LX-2细胞活化,上调eNOS表达:用辛伐他汀处理静止型LX-2细胞,与对照组相比,α-SMA和Ⅰ型胶原表达均无统计学差异,eNOS mRNA和蛋白的表达均增加（0.52±0.03 vs. 0.41±0.02;0.52±0.02 vs. 0.45±0.03,P<0.05）。3.5辛伐他汀抑制由L-NAME导致的eNOS低表达,抑制α-SMA和Ⅰ型胶原表达:用辛伐他汀干预经L-NAME预处理的LX-2细胞,与L-NAME组相比,α-SMA mRNA和蛋白表达均下降（0.28±0.02 vs. 0.34±0.02;0.26±0.02 vs. 0.36±0.02,P<0.05）,Ⅰ型胶原mRNA和蛋白表达均下降（0.30±0.02 vs. 0.40±0.03;0.26±0.02 vs. 0.31±0.02,P<0.05）,eNOS mRNA和蛋白的表达均增加（0.25±0.02 vs. 0.12±0.02;0.23±0.03 vs. 0.12±0.02,P<0.05）。3.6辛伐他汀上调静止型HSC中脂联素的表达:用辛伐他汀处理静止型LX-2细胞,与对照组相比,脂联素mRNA和蛋白表达增加,且呈时间和剂量依赖式递增。结论:1应用高脂饮食可以成功复制非酒精性脂肪性肝纤维化大鼠模型。2脂联素与AMPK相互作用,抑制或延缓非酒精性脂肪性肝纤维化的发生发展。3 iNOS和eNOS共同参与调节HSC的表型变化,脂联素通过调节HSC中NOS表达,抑制其活化,抑制肝纤维化发生发展。4辛伐他汀可通过增加肝组织及HSC中脂联素和eNOS表达,抑制HSC活化,揭示了辛伐他汀对非酒精性脂肪性肝纤维化的防治作用及其分子机制,为临床应用辛伐他汀防治非酒精性脂肪性肝纤维化提供理论依据。