论文部分内容阅读
VBNC(Viable but nonculturable)是活的非可培养,活的但失去了在常规培养基上生长繁殖的能力,但在合适条件下又可复苏的一种特殊休眠状态,且该休眠状态的存在使得用传统的平板计数法检测时造成活菌漏检,从而对杀菌技术的有效性存在高估的风险,给人民健康和生命安全带来潜在威胁。常见的食源性致病菌如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)在环境压力胁迫下会进入“VBNC”状态;基于传统的平板计数法,低温辅助超声波(Thermosonication,TS)可以有效地杀灭液态食品如果蔬汁中的食源性致病菌,但其是否会诱导致病菌进入VBNC状态还未可知。本文以S.Typhimurium为研究对象,建立了VBNC态的定量检测方法;探究了TS处理诱导S.Typhimurium形成VBNC状态的情况,并初步阐明其复苏的影响因素。主要研究结果如下:(1)结合反转录定量PCR技术(Reverse transcriptase quantitive PCR,RT-qPCR)和传统的平板计数法,建立了以RNA为基础的VBNC态的定量检测方法,同时建立了以DNA为基础的总菌数的定量检测方法。RT-qPCR方法能够准确定量TS处理后的S.Typhimurium的活菌数量,结合平板计数法可计算VBNC状态数量,并通过乙酸和双氧水的实验验证了该方法可以定量检测VBNC态S.Typhimurium。(2)研究了S.Typhimurium不同生长期、TS处理温度、时间、TS处理次数和自由基清除剂对TS诱导S.Typhimurium进入VBNC状态的影响。结果表明:对数生长期和衰退期的S.Typhimurium更易被TS诱导进入VBNC状态。高温、长时间TS处理更易诱导S.Typhimurium进入VBNC状态,例如在TS处理条件为380 W、52℃、60 min,52℃、25 min,57℃、10 min就可使全部存活状态的S.Typhimurium进入VBNC状态。TS处理次数对诱导S.Typhimurium进入VBNC状态没有影响。自由基清除剂可以抑制TS诱导S.Typhimurium进入VBNC态。(3)对于刚进入VBNC状态的S.Typhimurium分别采用直接升温法、添加化学物质、富营养法和添加麦芽糖法进行复苏。结果表明最适培养温度37℃、丙酮酸钠(20.00mmol/L)、4%蛋白胨可以促进TS诱导的VBNC状态的S.Typhimurium复苏;吐温20(24.44 mmol/L)阻碍了其复苏;而4℃培养条件和麦芽糖替换葡萄糖不能使VBNC态的S.Typhimurium复苏。通过本论文建立的定量检测方法能够快速有效定量检测VBNC态S.Typhimurium,从而克服了传统平板计数法对VBNC态菌的漏检,具有较为广泛的食源性致病菌检测应用领域,但将该检测技术应用到食品体系中还需进一步探索。