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研究中参照猪圆环病毒(Porcine circovirus, PCV)的基因组特点,自行分离鉴定PCV1-YA1和PCV2-SC株两个四川分离株,分别克隆其全基因;采用酶切、连接技术实现了两个毒株间部分基因交换,即将PCV2的ORF1克隆到PCV1上,构建重组病毒疫苗株PCV1-2;将PCV1的ORF1克隆到PCV2上构建重组病毒疫苗株PCV2-1。并采用单酶切消化、外切酶部分降解等操作构建了PCV2部分基因组的真核表达质粒pEGFP-C1-PCV2-SC-A。研究目的在于以期望能筛选研究猪圆环病毒新型基因工程疫苗,同时也为开展PCV病毒功能基因组学研究奠定基础。 1.猪圆环病毒Ⅰ型YA1株的全基因克隆及生物信息学分析 试验中采用1对特异性引物(P1/P2),1次性扩增获得了1759bp的猪圆环病毒Ⅰ型(PCV1-YA1株)全基因组,将其克隆于pMD18-T质粒,构建了重组质粒pMD18-T-PCV1-YA1并进行了核苷酸序列测定及氨基酸序列推导。PCV1-YA1株与Genbank中公布的其它7个PCV1毒株间的同源性高达98.8-99.9%。氨基酸序列推导显示,PCV1-YA1株ORF1编码312个氨基酸,在20-22aa(NPS)有一个糖基化位点;ORF2编码233个氨基酸,在102-104aa(NYS)存在一个糖基化位点。疏水性和跨膜区分析结果表明PCV1-YA1株的ORF1集中在3个部分出现9个潜在疏水性区域和2个跨膜区;ORF2则存在2个潜在疏水性区域和1个跨膜区。 2.猪PCV2-SC株的分离鉴定及其全基因克隆与生物信息学分析 ELISA检测及荧光抗体检测确诊猪圆环病毒临床病例,分离了猪圆环病毒野毒(PCV2-SC)株。本试验中采用1对特异性引物(P3/P4),1次性扩增获得了1767bp的猪圆环病毒Ⅱ型PCV2-SC株全基因组,将其克隆于pMD18-T质粒,构建了重组质粒pMD18-T-PCV2-SC并进行了核苷酸序列测定及氨基酸序列推导。通过BLAST与GenBank中来自美洲、欧洲及中国的部分PCV2毒株进行同源性比较分析,结果PCV2-SC株与Genbank中公布的其它16个毒株间的同源性介于93.6-98.6%,而与PCV1-YA1株相比其同源性则仅为69.2%。并对其主要ORF与其它PCV2毒株进行了比较,结果PCV2-SC株的ORF1与16个毒株的ORF1之间同源性为94.7-99.4%;ORF2的同源性则为90.3-99.6%。利用测定的PCV2-SC株ORF1和ORF2核苷酸序列推导了其对应的氨基酸序列,其中ORF1