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本文主要从以下几方面进行了论述: 第一部分 目的:研究抗原处理相关转运蛋白(TAP)和HLA-I类分子在恶性黑素瘤组织中的表达。探讨这些分子的表达与恶性黑素瘤病理特征的关系。 方法:应用免疫组织化学方法检测77例恶性黑素瘤组织TAP1、TAP2和HLA-I类分子的表达,并对这几种蛋白的表达进行半定量分析,以20例色素痣组织作为对照研究。 结果:在77例恶性黑素瘤组织中,TAP1、TAP2和HLA-I类分子的阳性表达率分别为23.38％,11.69%和63.64%,HLA-I类分子的表达与TAP1和TAP2成正相关。然而TAP1、TAP2和HLA-I类分子几乎在所有的色素痣组织中都为阳性表达。在恶性黑素瘤组织中,TAP1和TAP2的表达下降与肿瘤的侵袭性,Clark分级和肿瘤浸润的淋巴细胞密切相关。HLA-I类分子的表达下降仅仅与肿瘤浸润的淋巴细胞相关。 结论:在恶性黑素瘤组织中TAP1、TAP2和HLA-I类分子的表达下降与人恶性黑素瘤细胞的免疫逃逸表型有关。而TAP1和TAP2的表达下降是导致HLA-I类分子表达下降的重要原因。 第二部分 目的:构建抗原处理相关转运蛋白(TAP)和EGFP融合蛋白基因的重组真核表达载体pEGFP-TAP1和pEGFP-TAP2。并转染至A375细胞中进行表达,鉴定融合蛋白的生物学活性。为TAP-荧光融合蛋白在肿瘤示踪、定位、显像等方面的研究奠定基础。 方法:从正常人PBMC中提取基因组DNA。设计两对引物引入酶切位点HindⅢ和BamHⅠ,采用PCR的方法,分别扩增全长TAP1和TAP2序列。将获得的单链抗体基因克隆至pGEM-T载体(TAP-T),转化大肠杆菌DH5α,进行蓝白筛选,挑取阳性克隆扩增。提取质粒以HindⅢ和BamHⅠ双酶切鉴定,并测序证实正确后,亚克隆至pEGFP-N1,获得pTAP-EGFP,转染A375细胞,倒置相差荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达。 结果:测序结果表明获得了正确的TAP1及TAP2基因序列;亚克隆至pEGFP-N1后,HindⅢ和BamHⅠ双酶切可见约2.5Kb和2.0Kb的小片段和约4.5Kb的大片段,与理论计算值相符,表明pTAP1-EGFP和pTAP2-EGFP真核表达载体构建成功;表达载体瞬时转染A375细胞,24小时后,可见绿色荧光在细胞浆中均匀分布。 结论:成功构建TAP1-EGFP和TAP2-EGFP融合蛋白的真核表达载体pTAP1-EGFP和pTAP2-EGFP,融合蛋白可在A375细胞中表达,并发绿色荧光,本实验为进一步将该融合蛋白作为肿瘤示踪、定位、显像的特异性分子奠定了基础。 第三部分 目的:将pTAP1-EGFP和/或pTAP2-EGFP转入恶性黑素瘤细胞株,并筛选稳定转染细胞株。比较转染前后TAP表达的变化。将pTAP-EGFP和pDsRed2-ER共转染至A375细胞株,观察TAP在A375中表达后的亚细胞定位。 方法:在mRNA和蛋白水平检测三种恶性黑素瘤细胞株A375,A875和KZ28中TAP1和TAP2的水平。选择TAP表达最低的细胞株,转入pTAP1-EGFP和/或pTAP2-EGFP,G418筛选稳定转染细胞株,并检测转染后TAP1和TAP2表达水平的变化。将pDsRed2-ER和pTAP1-EGFP或pTAP2-EGFP共转染入A375细胞系,激光共聚焦显微镜下观察TAP1-EGFP和TAP2-EGFP融合蛋白的亚细胞定位。 结果:以正常黑素细胞作为对照,三种恶性黑素瘤细胞中,A375的TAP1,TAP2表达水平最低。将pTAP1-EGFP和/或pTAP2-EGFP转染A375细胞株后筛选出稳定克隆。转染了pTAP1-EGFP和/或pTAP2-EGFP后能明显增加A375细胞TAP1和TAP2在mRNA和蛋白水平的表达。共转染了pDsRed2-ER和pTAP1-EGFP或pTAP2-EGFP后,在激光共聚焦显微镜下观察发现TAP1-EGFP和TAP2-EGFP融合蛋白的绿色荧光能够与pDsRed2-ER的红色荧光重叠,证实TAP1-EGFP和TAP2-EGFP融合蛋白能够定位在内质网上。 结论:pTAP1-EGFP和/或pTAP2-EGFP质粒转染能显著提高A375细胞系TAP在基因和蛋白水平的表达。所构建的pTAP1-EGFP和/或pTAP2-EGFP质粒在A375细胞系中表达成为TAP1-EGFP和TAP2-EGFP融合蛋白后,对TAP的天然构象没有影响,并能够准确定位在内质网上,为研究TAP所诱导的后续免疫效应提供了良好的基础。 第四部分 目的:将pTAP1-EGFP和/或pTAP2-EGFP转入恶性黑素瘤细胞株A375,并筛选稳定转染细胞株。探讨TAP的表达上调对HLA-Ⅰ的影响以及与肿瘤抗原递呈和诱导特异性细胞免疫反应的关系。 方法:在mRNA和蛋白水平检测三种恶性黑素瘤细胞株A375,A875和KZ28中HLA-Ⅰ类分子的水平。选择TAP表达最低的细胞株A375,转入pTAP1-EGFP和/或pTAP2-EGFP,G418筛选稳定转染细胞株,并检测转染后HLA-Ⅰ类分子表达水平的变化。利用Melan-A体外刺激PBMC诱导产生Melan-A特异性CTL,并将其与恶性黑素瘤细胞共培养,LDH释放法检测肿瘤抗原特异性CTL对转染前后恶性黑素瘤细胞的杀伤,流式细胞仪检测能够产生IL-12和IFN-γ的CD8+T细胞的数量。 结果:三种恶性黑素瘤细胞中,A375的TAP1,TAP2和HLA-Ⅰ类分子的表达水平最低。将pTAP1-EGFP和/或pTAP2-EGFP转染 A375细胞株后筛选出稳定克隆。pTAP1-EGFP/A375克隆以及pEGFP-TAP1+TAP2/A375克隆相对于pTAP2-EGFP/A375克隆以及空载体组能明显增加Melan-A特异性CTL的数量,这种CTL能杀伤pTAP1-EGFP/A375克隆和pEGFP-TAP1+TAP2/A375克隆。与pTAP1-EGFP/A375克隆以及pTAP2-EGFP/A375克隆相比,pEGFP-TAP1+TAP2/A375克隆能够诱导产生较多的能分泌IL-12和IFN-γ的Melan-A特异性CTL。 结论:TAP的表达上调不仅能增强A375细胞中的肿瘤抗原递呈,而且同时能诱导Melan-A特异性CTL产生IL-12和IFN-γ,为研究TAP在恶性黑素瘤的免疫治疗中的作用和机制提供了一定的实验基础。