1.背景与目的胶质瘤是中枢神经系统发生率最高的原发性恶性肿瘤疾病,具有极高的死亡率。目前,胶质瘤的主要治疗方法是手术结合放化疗的综合治疗方案,但患者治疗效果普遍不佳,极易复发,生存时间较短。基于肿瘤免疫和免疫杀伤机制的抗肿瘤免疫治疗被视为最有希望治愈胶质瘤及其它恶性肿瘤的方法。随着肿瘤发生、发展机制和肿瘤免疫反应研究的深入,免疫微环境的重要性日益显现。胶质瘤免疫微环境的组成成分极为复杂,包括胶质瘤细胞、浸润的各型淋巴细胞、小胶质细胞、内皮细胞、部分实质细胞等多种细胞以及上述细胞合成、分泌的细胞因子、生长因子、趋化因子等,共同发挥促进肿瘤生长、血管发生、侵袭和抗凋亡等作用。因此,针对肿瘤免疫微环境的研究,有助于了解和明确微环境中不同细胞和细胞因子在肿瘤发生、发展过程中的作用,并寻找潜在的肿瘤免疫治疗靶点。白介素6（Interleukin 6,IL6）是本课题组前期采用生物信息学分析,于中国胶质瘤基因组图谱计划（Chinese Glioma Genome Atlas,CGGA）和癌症基因组图谱计划（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库中筛选出的胶质母细胞瘤免疫相关性最高的基因之一。IL6在胶质瘤和胶质母细胞瘤中具有较高的表达,并可作为影响患者预后的高危影响因子。虽然目前已有部分研究报道了IL6在胶质瘤发生、发展中的作用,但白介素6受体（Interleukin 6 receptor,IL6R）在胶质瘤中的作用并未提及,亦无IL6R参与IL6促胶质瘤生长、侵袭的报道。此外,由于胶质瘤的组织成分和分子遗传学背景存在较大的异质性,传统的世界卫生组织（World health organization,WHO）病理分级不能准确评估胶质瘤的具体特征,而分子分型可有效弥补传统WHO病理分级的缺陷。故本研究以IL6R为主要对象,首先观察IL6R在胶质瘤各分子分型中是否存在表达差异,进而观察IL6R的促胶质瘤发生、发展作用,以及是否参与IL6调控胶质瘤作用。活化T细胞核因子1（nuclear factor of activated T cells 1,NFAT1）是本课题长期研究的胶质瘤相关基因,作为免疫调控转录因子,在调控胶质瘤发生、侵袭、肿瘤免疫活化或抑制中均具有重要作用。NFAT1可参与T淋巴细胞的活化,促进IL2、IL4、IL17等细胞因子的合成和分泌,NFAT1还可参与胶质母细胞瘤中IL13Rα2等白介素受体的合成,但NFAT1在胶质瘤中是否具有调控IL6、IL6R的作用尚无研究报道。故本研究进一步针对IL6、IL6R的表达调控进行分析,从而完善IL6、IL6R在胶质瘤发生、发展过程中的作用。2.研究方法2.1生物信息学分析通过GlioVis工具（http://gliovis.bioinfo.cnio.es）获取TCGA、CGGA等胶质瘤数据库中IL6、IL6R、NFAT1的表达及患者临床资料信息,采用t检验比较各种分型胶质瘤的IL6、IL6R表达水平是否存在差异,是否具有预后意义,并进一步分析NFAT1与IL6、IL6R表达水平的相关性。采用UCSC数据库（http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway）检索IL6、IL6R的启动子区序列,在PROMO（http://alg gen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoini t.cgi?dirDB=TF₈.3）中输入IL6、IL6R的启动子区序列,预测是否存在NFAT1的结合位点。2.2胶质瘤细胞培养人胶质瘤细胞系U87、U251、T98G、SNB19均采用含有10%FBS的DMEM高糖型培养基培养,培养条件37℃,5%CO₂浓度。患者来源胶质瘤干细胞取自手术切除的新鲜临床胶质瘤标本,经Ⅱ型胶原酶,DNaseⅠ、红细胞裂解液处理提取单细胞,培养于2%B27,20ng/mL rh-bFGF和rh-EGF的DMEM/F12培养基中,培养条件37℃,5%CO₂浓度。针对患者来源胶质瘤干细胞,进一步采用免疫荧光检测胶质瘤干细胞标志物CD133、诱导分化后星形胶质细胞的标志分子GFAP、原始神经上皮细胞标志物β-ⅢTubulin等,证实胶质瘤干细胞。采用qPCR检测胶质瘤干细胞中各分子分型的标志物表达水平,确定其分子分型。2.3慢病毒感染胶质瘤细胞IL6R和NFAT1过表达慢病毒,IL6R shRNA1、IL6R shRNA2、NFAT1 shRNA慢病毒均由上海吉凯生物科技有限公司设计并合成,分别感染胶质瘤干细胞M1、N2和胶质瘤细胞系U87、T98G,经western blot,qPCR验证过表达或沉默效率。2.4蛋白免疫印迹实验收集生长状态良好的患者来源胶质瘤干细胞和胶质瘤细胞系,全蛋白提取试剂盒提取细胞全蛋白,BCA测定蛋白浓度,加入蛋白样品上样缓冲液,采用4-20%浓度预制胶电泳、转膜、脱脂奶粉封闭、孵育相应的一抗、二抗,ECL曝光检测,检测的指标包括IL6、IL6R、NFAT1等。2.5 qPCR实验收集生长状态良好的患者来源胶质瘤干细胞和胶质瘤细胞系,采用Takara RNA提取试剂盒提取胶质瘤干细胞mRNA,检测RNA浓度,采用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒去除基因组DNA并反转构建cDNA文库,采用TransStart Tip Green qPCR SuperMix将构建好的cDNA进行定量PCR反应,检测的指标包括IL6、IL6R、NFAT1等。2.6免疫荧光收集生长状态良好的患者来源胶质瘤干细胞和胶质瘤细胞系,接种至激光共聚焦培养皿中培养,培养24h后观察细胞形态良好则给予4%多聚甲醛固定,0.5%Trinton X-100室温通透,5%BSA室温封闭,分别加入CD133、GFAP、β-ⅢTubulin等抗体4℃孵育过夜,加入相应的荧光二抗室温孵育30min,加入含有Dapi的防荧光淬灭封片剂,尽早置于荧光显微镜下观察2.7细胞活性检测收集生长状态良好的患者来源胶质瘤干细胞和胶质瘤细胞系,接种至96孔板中,每孔1000个细胞,每组细胞重复4孔,共铺板5块96孔板,向孔板中加入20μl MTS溶液,37℃孵育3h,采用酶标仪于495nm波长下检测各胶质瘤细胞吸光光度值,绘制细胞增殖曲线。2.8集落形成实验收集生长状态良好的患者来源胶质瘤干细胞和胶质瘤细胞系,接种至6孔板中,每孔200个细胞,每3-4d换液一次,连续培养两周,采用1%结晶紫染色,倒置显微镜拍照,计数细胞克隆形成数和克隆形成率。2.9细胞划痕实验收集生长状态良好的患者来源胶质瘤干细胞和胶质瘤细胞系,接种至6孔板中,每孔1×10⁵个细胞,待细胞汇合度100%时以1ml枪头划痕,弃培养基,PBS清洗脱落的细胞,以不含血清的DMEM培养基继续培养24h,倒置显微镜拍照记录各组胶质瘤细胞划痕后0h、24h视野,采用Image J分析计算细胞愈合率。2.10神经球形成实验收集生长状态良好的患者来源胶质瘤干细胞,接种至24孔板中,每孔细胞数200,连续培养7d,倒置显微镜观察、拍照,记录神经球形成数目、大小。2.11 Transwell实验首先以1:8比例稀释Matrigel基质胶,向Transwell小室的上室中加入100μl稀释的基质胶,放入37℃孵箱中30min等待基质胶凝固,选取生长状态良好的患者来源胶质瘤干细胞和胶质瘤细胞系,接种至Transwell小室的上室中,每孔8×10⁴个细胞,下室加入600μl 20%FBS的DMEM培养基,继续培养20h,采用HE染色,倒置显微镜下拍照,计数穿过的胶质瘤细胞数。2.12 Tunel凋亡检测收集生长状态良好的患者来源胶质瘤干细胞和胶质瘤细胞系,接种至激光共聚焦培养皿中,每个培养皿2×10⁴个细胞,次日4℃预冷的4%多聚甲醛固定,Trinton X-100通透,加入Tunel反应缓冲液室温避光孵育90min,加入含有Dapi的防荧光淬灭封片剂,荧光显微镜下观察计数Tunel阳性细胞数,计算细胞凋亡率。2.13免疫组化多聚甲醛固定新鲜提取的小鼠皮下成瘤或颅脑组织,乙醇梯度脱水,二甲苯通透,石蜡包埋后切片。二甲苯脱蜡、酒精梯度复水,去离子水水化,去除内源性过氧化物酶,柠檬酸钠缓冲液抗原修复,山羊血清封闭液室温封闭,IL6R一抗孵育过夜、依次孵育二抗、链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液,DAB显色,苏木素染色,酒精梯度脱水,二甲苯通透,中性树胶封片,晾干后正置显微镜下观察、拍照,计算阳性表达率。2.14 HE染色石蜡切片处理同免疫组化,待去离子水水化后,依次给予苏木素和伊红染色,各2min,显微镜观察HE染色深度,酒精梯度脱水,二甲苯通透,中性树胶封片,大体显微镜拍照观察。2.15酶联免疫吸附试验首先向96孔板中加入100μl Assay Diluent RD1W,收集生长状态良好的患者来源胶质瘤干细胞和胶质瘤细胞系的培养基上清液,同时倍比稀释人IL6标准品,依次加入96孔板中,室温孵育2h,加入生物素化IL6抗体室温孵育2h,加入辣根过氧化物酶标记的反应液室温避光孵育20min,最后加入反应终止液,采用酶标仪检测各样品和标准品吸光光度值,计算各样品IL6浓度。2.16双荧光素酶报告基因检测选取生长状态良好的胶质瘤干细胞和胶质瘤细胞系,接种至96孔板中,待汇合度达到70-90%时,经lipo3000转染pGL3-IL6-mt、pGL3-IL6-wt、pGL3-IL6R-mt、pGL3-IL6R-wt及pRL-TK质粒,持续培养48h,采用Dual-Glo?Luciferase Assay System和分光光度计检测荧光素强度,计算各组胶质瘤细胞的相对荧光强度,比较其差异。2.17染色质免疫共沉淀选取生长状态良好的胶质瘤干细胞和胶质瘤细胞系,甲醛交联,裂解细胞,超声剪切基因组DNA,留取20μl样品作为Input用于后续检测,余下样品加入适量NFAT1抗体4℃缓慢摆动过夜、洗脱、解交联、纯化DNA后行qPCR检测IL6、IL6R的表达差异,确定NFAT1调控IL6、IL6R与否。2.18裸鼠皮下成瘤实验观察胶质瘤细胞状态,选取生长状态良好的患者来源胶质瘤干细胞,消化后调整细胞浓度至1×10⁸个/ml,向裸鼠颈背部注射200μl,每组胶质瘤细胞注射5只裸鼠,注射后每五天观察裸鼠状态,测量皮下成瘤的长、短径,计算肿瘤体积,肿瘤体积V=（D×d²）/2（mm³）,D为长径、d为短径;注射后35d以颈椎脱位法处死裸鼠,剥离瘤体,称量瘤体重量。2.19裸鼠颅内成瘤实验观察胶质瘤细胞状态,选取生长状态良好的患者来源胶质瘤干细胞,消化后调整细胞浓度至1×10⁸个/ml,采用0.75%的戊巴比妥钠麻醉裸鼠,将裸鼠固定于立体定位仪上,切开头皮,于矢状缝右侧2mm、前囟后2mm穿刺,微量注射器缓慢插入颅脑3mm,注射3μl上述细胞悬液,泵控注射,注射速度0.5μl/min,持续注射6min,拔出微量注射器,骨蜡封堵颅骨穿刺口,缝合头部皮肤,待裸鼠苏醒后继续饲养,每日观察裸鼠状态,记录裸鼠存活时间,计算各组生存率。针对当日死亡裸鼠,立即取出脑组织,固定、切片,分别行HE、免疫组化染色,计算颅内成瘤体积。3.结果3.1 IL6、IL6R在不同分型胶质瘤中的表达在TCGA胶质母细胞瘤数据库中,间质型胶质母细胞瘤中IL6、IL6R的表达水平分别均明显高于经典型、神经元型和前神经元型,而IL6、IL6R的表达水平在经典型、神经元型和前神经元型间均无明显差异。在TCGA胶质瘤数据库中,IDH野生型IL6、IL6R表达水平均高于IDH突变型。在TCGA胶质瘤数据库、TCGA胶质母细胞瘤数据库和Rembrandt胶质瘤数据库中,经Kaplan-Meier生存分析,IL6、IL6R高表达患者平均生存时间明显小于低表达患者。采用western blot和qPCR检测8株不同胶质瘤干细胞,IL6、IL6R在间质型胶质瘤干细胞M1、M2的表达最高,而前神经元型胶质瘤干细胞P1、P2的表达最低。针对目前较为常用的胶质瘤细胞系U87、U251、SNB19、LN229及T98G进行western blot检测,结果证实恶性程度最高、侵袭性最强的胶质母细胞U87中IL6R的表达最高,恶性程度最低、侵袭性最弱的胶质瘤细胞T98G中的表达最低。3.2 IL6R对胶质瘤细胞增殖活性的调控采用MTS检测细胞活性,胶质瘤干细胞M1和胶质母细胞U87分别经IL6R沉默后,吸光光度值均明显低于对照组,而胶质瘤干细胞N2经IL6R过表达后,吸光光度值明显大于对照组。采用集落形成进一步检测细胞增殖活性,胶质瘤干细胞M1和胶质母细胞U87分别经IL6R沉默后,克隆形成率明显低于对照组,而胶质瘤干细胞N2经IL6R过表达后,克隆形成率明显大于对照组。本研究进一步采用神经球形成实验检测IL6R对增殖的调控作用,胶质瘤干细胞M1经IL6R沉默后,神经球大小、形成数目亦小于对照组,而胶质瘤干细胞N2经IL6R过表达后,神经球大小、形成数目亦大于对照组。3.3 IL6R对胶质瘤细胞迁移和侵袭的调控采用细胞划痕检和transwell实验测胶质瘤细胞的迁移作用,胶质瘤干细胞M1和胶质瘤细胞U87经NFAT1沉默后,细胞迁移率和细胞侵袭数均明显低于对照组,而胶质瘤干细胞N2经IL6R过表达后,细胞迁移率和细胞侵袭数均明显高于对照组。3.4 IL6R对胶质瘤凋亡的调控采用Tunel实验检测IL6R表达对胶质瘤细胞的凋亡作用,胶质瘤干细胞M1经IL6R沉默后,凋亡细胞数明显均高于对照组,而胶质瘤干细胞N2经IL6R过表达后,凋亡细胞数明显低于对照组。3.5 IL6R对肿瘤发生的调控胶质瘤干细胞M1经IL6R沉默后注入裸鼠颅内,与对照组比较,裸鼠生存率显著延长,成瘤组织体积显著减小;而胶质瘤干细胞N2经IL6R过表达后注入裸鼠颅内,裸鼠生存率显著缩短,肿瘤体积明显增大。裸鼠皮下成瘤实验再次发现IL6R沉默后皮下成瘤体积及瘤体重量均显著小于对照组,而IL6R过表达后,皮下成瘤体积及瘤体重量均大于对照组。3.6 IL6R介导IL6体外刺激对胶质瘤细胞增殖的调控人重组IL6体外刺激胶质瘤干细胞M1和胶质母细胞U87,给药浓度依次为10ng/ml,20ng/ml,100ng/ml,MTS检测结果发现随着IL6作用浓度的增加,M1、U87的吸光光度值逐次递增,且均高于对照组,但IL6作用浓度20ng/ml与100ng/ml时,二者吸光光度值相近,故本课题后续实验IL6作用浓度若无特殊说明均选择20ng/ml。胶质瘤干细胞M1沉默IL6R后,给予IL6刺激后吸光光度值和集落形成数无明显升高,而shRNA对照组给予等剂量IL6刺激后,吸光光度值和集落形成数显著高于IL6未刺激的shRNA对照组和IL6刺激的IL6R沉默组。光学显微镜拍照观察贴壁后的M1细胞发现,shRNA对照组细胞给予IL6刺激后细胞生长迅速,汇合度较高,而IL6R沉默后,给予IL6刺激细胞生长缓慢,汇合度较低。3.7 IL6R介导IL6体外刺激对胶质瘤细胞迁移和侵袭的调控给予IL6刺激shRNA对照组M1细胞后,细胞迁移率和侵袭的细胞数明显大于IL6未刺激对照组。而IL6R沉默后给予IL6刺激,细胞迁移率和侵袭的细胞数与IL6未刺激IL6R沉默组和IL6未刺激对照组均无明显差异,且均低于IL6刺激后对照组。3.8 IL6R介导IL6体外刺激对胶质瘤细胞凋亡的调控给予IL6刺激shRNA对照组M1细胞后,细胞凋亡率明显小于IL6未刺激对照组,而IL6R沉默后给予IL6刺激,细胞凋亡率与IL6未刺激IL6R沉默组和IL6未刺激对照组均无明显差异,且均大于IL6刺激后对照组。3.9 NFAT1调控IL6、IL6R与NFAT1的表达本研究首先在TCGA胶质瘤数据库中检测IL6、IL6R及NFAT1的表达,发现IL6、IL6R的表达与NFAT1存在显著的相关性。采用western blot检测发现NFAT1沉默后,IL6、IL6R的表达显著下调,而NFAT1过表达后IL6、IL6R的表达显著升高。采用免疫荧光检测发现NFAT1沉默后,IL6R的表达显著下调,而NFAT1过表达后IL6R的表达显著升高。采用ELISA检测发现NFAT1沉默后,培养基上清液中分泌的IL6水平明显降低,而NFAT1过表达后,培养基上清液中分泌的IL6水平明显升高。本研究进一步针对IL6、IL6R的启动子区进行分析,IL6、IL6R启动子区均存在大概率的NFAT1结合位点,于是设计萤火虫荧光素酶报告基因和ChIP实验,证实NFAT1可参与IL6、IL6R的转录调控。3.10 NFAT1调控肿瘤的发生基于上述研究结果,本研究进一步探讨NFAT1沉默对肿瘤发生的影响,裸鼠皮下成瘤结果发现患者来源胶质瘤干细胞M1的NFAT1沉默后,皮下成瘤体积和重量均明显小于NFAT1对照组4.结论4.1 IL6、IL6R在间质型胶质母细胞瘤和IDH野生型胶质瘤中具有最高的表达,且IL6、IL6R高表达患者生存时间显著缩短,IL6、IL6R的表达与胶质瘤的侵袭表型相关。4.2针对IL6R过表达和沉默的双向调控,证实胶质瘤中IL6R过表达可促进胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和肿瘤发生,抑制凋亡。4.3 IL6R在IL6促进胶质瘤细胞的增殖、侵袭,抑制凋亡中具有关键作用,IL6R可成为胶质瘤治疗的重要靶点。4.4 NFAT1可直接转录调控IL6、IL6R在胶质瘤中的表达,并进一步证实NFAT1具有促进胶质瘤发生的作用,与IL6、IL6R的生物学作用一致,完善了NFAT1-IL6/IL6R信号通路,支持NFAT1作为胶质瘤治疗的重要靶点。