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研究背景和目的PI3K/AKT信号通路是一条极为重要的信号通路,它控制着细胞增殖、生长、代谢、生存和血管生成,因此也是肿瘤发生发展的关键通路之一[1-3]。AKT是该信号通路的关键分子,活化的AKT可以激活上百种底物,调控细胞的生长、增殖、代谢、运动、侵袭、血管生成等多种功能[4-7]。PI3K/AKT信号通路过度激活可导致肿瘤[1-3],过度抑制则导致胰岛素抵抗[8]。体内多种激素、生长因子,如胰岛素(insulin),生长激素(growth hormone),表皮细胞生长因子(epidermal growth factor),肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor)都可激活PI3K/AKT信号通路而我们却保持健康。因此阐明AKT信号通路保持稳态的机制对肿瘤的防治和糖尿病的治疗极为重要。我们课题组前期研究表明,在生长激素导致的胰岛素抵抗中和酒精急性刺激下,PTEN与PI3K p85亚基之间的相互作用对该信号通路的稳态起着重要作用[9,10]。本课题拟研究HGF-INS,EGF-INS,GH-EGF三种激素相互作用对PI3K/AKT信号通路的影响及其机制,揭示PI3K/AKT信号通路保持稳态的机制。方法1.动物实验检测激素/生长因子相互作用对PI3K/AKT信号通路的影响为研究HGF-INS,EGF-INS,GH-EGF三种激素/生长因子组合间的相互作用对PI3K/AKT信号通路的影响,健康的雄性Balb/c小鼠分为激素长时间预刺激组和短时间组。小鼠在处死前3小时(长时间预刺激组)或处死前30分钟(短时间预刺激组)腹腔注射HGF,EGF,GH,两组均在处死前15分钟相应地注射胰岛素,胰岛素,EGF刺激。处死后提取肝脏组织蛋白行western blot和/或免疫荧光技术检测p-AKT(S473)和PTEN表达水平。2.细胞实验检测激素/生长因子相互作用对PI3K/AKT信号通路的影响常规培养HepG2和/或HEK 293T细胞,在裂解前30min或4h分别给予细胞HGF,EGF,GH或不给予刺激(control组);在裂解前10min分别相应给予胰岛素、胰岛素、EGF刺激。Western blot和/或免疫荧光比较三组p-AKT和PTEN表达水平。3.激素/生长因子相互作用对PI3K/AKT信号通路影响的机制研究HepG2细胞和/或HKE 293T细胞按实验方案分别转染PTEN突变型C124S质粒,PTEN突变型G129E质粒或PI3K p85亚基N末端缺失型p50调节亚基质粒后,用western blot和/或免疫荧光检测细胞接受第一种激素/生长因子(HGF,EGF,GH)不同方案预刺激(不刺激、30min、4h)后对第二种激素/生长因子介导的p-AKT表达水平的影响。结果:1.体内实验中第一种激素/生长因子长时间预刺激可抑制第二个激素/生长因子介导的PI3K/AKT信号通路Western blot和/或免疫荧光结果显示,3小时激素/生长因子预刺激后,第二种激素/生长因子介导小鼠肝脏p-AKT表达水平显著减少而PTEN表达水平无显著改变;2.体外实验中第一种激素/生长因子长时间预刺激可抑制第二个激素/生长因子介导的PI3K/AKT信号通路Western blot和/或免疫荧光结果显示,在HepG2和/或293t细胞中,4小时激素/生长因子预刺激后,第二种激素/生长因子介导的p-AKT表达水平显著减少;而30分钟预刺激后,p-AKT表达水平无显著改变而PTEN表达水平无显著改变。3.转染C124S或G129E后,第一种激素/生长因子长时间预刺激对第二种激素介导的PI3K/AKT信号通路抑制作用消失Western blot和/或免疫荧光结果显示,转染C124S或G129E后,control组、30min组、4h组的p-AKT水平无明显改变。4.转染p50后,第一种激素/生长因子长时间预刺激对第二种激素介导的P13K/AKT信号通路抑制作用消失Western blot结果显示,转染p50后,control组、30min组、4h组的p-AKT水平无明显改变。结论本研究通过在动物体内及不同细胞系中,研究了包括4种激素/生长因子的3种不同组合的相互作用对PI3K/AKT信号通路的影响,发现长时间激素预刺激后可抑制第二个激素介导的AKT信号通路,而短时间预刺激则不改变第二个激素介导的AKT信号通路,这可能是PI3K/AKT信号通路保持稳态的原因之一。在此调控中,PTEN的表达量无显著改变,提示PTEN和p85在激素间的抑制作用中起重要的负性调控作用,而且可能是通过PTEN-P85之间的相互作用而实现的。