志贺菌属细菌又称痢疾杆菌，是感染性腹泻的主要病原体之一。它所引起的细菌性痢疾是一种全球流行的急性肠道传染病，在全世界年病例数超过2亿，年死亡人数约60万人，其中2／3是儿童。尽管世界各国在菌痢防治上付出了巨大努力，但由于志贺菌菌型多、菌株易变迁、感染后免疫力不持久、型间无交叉免疫等等原因，在卫生条件相对落后的发展中国家，菌痢仍难以预防；而在治疗上，随着现代医学技术的发展，特别是近年来由于滥用抗菌药物，志贺菌频繁发生变异产生耐药株，且耐药率高、耐药产生速度快、耐药范围广，不断给细菌性痢疾的治疗带来新的挑战。由此，细菌性痢疾的耐药性问题已成为临床和流行病学菌痢防治上的重要课题。喹诺酮类抗生素是目前治疗菌痢的主要药物。上世纪80年代喹诺酮类药物应用于临床，志贺菌属细菌起初对其敏感性较高，达95％以上，菌痢的疗效曾一度改观。但近年来已发现敏感性降至85％以下。鉴于菌痢在肠道传染病防治工作中的重要地位及喹诺酮类药物目前在临床治疗感染性腹泻的重要性，研究志贺菌属细菌的耐药性，尤其对喹诺酮类药物的可能机制显得十分必要。喹诺酮耐药机制研究的最新成果显示，细菌耐受喹诺酮类药物的机制可能有以下四个方面：①靶基因突变，主要是编码DNA促旋酶A亚基的基因gyrA和编码拓扑异构酶Ⅳ的C亚基的基因parC突变；②主动外排系统；③细菌细胞膜通透性的改变；④质粒介导的耐药。其中前三种耐药机制均为染色体突变介导的。目前认为，靶基因突变在细菌对喹诺酮类耐药中起重要作用，而另两种机制是细菌产生包括喹诺酮在内的多重耐药的主要机制。虽然到目前为止，对志贺菌属细菌耐喹诺酮类药物机制的研究，包括了临床分离耐药株和体外诱导耐药突变株，而且对各种机制的研究都有所涉及，但是对各种机制在志贺菌属细菌耐药形成中各自的地位与相互关系尚需进一步探明。为了解喹诺酮类各种耐药机制在志贺菌属细菌耐药形成中各自的地位、作用特点与相互关系，本研究以药物选择性——基因突变——耐药形成理论为出发点，采用人工诱导的方式，用氟喹诺酮类抗生素诺氟沙星对志贺菌敏感株进行体外诱导，使之逐步产生耐药性，通过测定诺氟沙星、四环素、氯霉素、氨苄青霉素对各代菌株的最低抑菌浓度检测耐药程度的变化及多重耐药性的获得，并对各代菌株的gyrA基因和parC基因进行N末端编码区的聚合酶链反应（PCR）扩增，运用PCR-SSCP对其突变性进行检测，对检测出的突变菌株进行核酸序列分析，以明确靶基因突变位点及方向，探讨耐药程度与突变位点之间的关系，为指导临床早期发现耐药菌株的存在，合理、有效地应用喹诺酮类抗生素，防止其耐药性进一步增加提供依据，同时也为喹诺酮类新药品种的开发提供一定依据。并用能量抑制剂碳酰氰间氯苯腙（Carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone，CCCP）抑制主动外排作用，观察此过程中诺氟沙星对细菌最低抑菌浓度（MIC）的变化，探讨主动外排系统在志贺菌多重耐药中的作用及其与靶基因突变机制在志贺菌属细菌喹诺酮耐药形成中的关系，为菌痢的防治提供理论依据和对策。方法1．菌株的复苏与鉴定：对我教研室4℃冰箱中以半固体穿刺法保存的48株志贺菌在LB平板上划线复苏并重新进行生化及血清学鉴定，以保证菌株的可靠性。2．敏感野生株的筛选：采用Kirby-Bauer纸片法进行菌株对四环素、氯霉素、氨苄青霉素、萘啶酸、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星的药敏试验，以对以上抗菌药物均敏感的菌株为敏感野生株（wild type，WT），从中选择一株作为实验诱导株。3．诱导方法：诺氟沙星浓度从1／4×MIC₀（诺氟沙星对诱导株原代的最低抑菌浓度）开始，以2倍递增，每一浓度诱导两代。当诺氟沙星浓度达到1μg／ml后，浓度以1μg／ml递增，直至诱导剂浓度大于或等于256×MIC₀。当诱导剂的浓度达到4、8、16、32μg／ml时，菌株在该浓度中诱导培养两天后，暂不继续诱导传代，先作4次无诱导剂传代培养后，再接种于含相同浓度诱导剂的LB固体平皿过夜培养，挑选生长良好的单菌落继续诱导培养，以保证耐药菌株为非适应性耐药。4．抗菌药物最低抑菌浓度（minimum inhibition concentration，MIC）测定：用琼脂稀释法测定抗菌药物诺氟沙星、四环素、氯霉素、氨苄青霉素对实验诱导株各代的最低抑菌浓度。5．喹诺酮类作用的靶基因gyrA和parC的单链构象多态性（PCR-SSCP）分析：PCR扩增各代菌株的gyrA和parC基因，扩增产物经限制性内切酶HinfⅠ消化，变性后经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据单链带数目和位置判断有无基因突变。6．突变菌株PCR产物的DNA测序。7．能量抑制剂CCCP对实验诱导多重耐药志贺菌主动外排作用的抑制：用于琼脂稀释法药敏试验的M-H培养基中加入能量抑制剂CCCP（10μg／ml），测定诺氟沙星最低抑菌浓度MIC，观察各代菌株加入抑制剂前后对抗菌药物的MIC。结果1．菌株复苏与鉴定：共复苏菌株48株，其中江西铜鼓福氏志贺菌11株，郑州福氏志贺菌13株，郑州宋内志贺菌8株，郑州痢疾志贺菌3株，商丘睢县福氏志贺菌12株，宋内志贺菌1株。2．敏感野生株筛选：48株志贺菌中筛选出3株敏感野生株，N8、Z10、Z11，占菌株总数的6.25％。选择N8作为实验诱导株。3．诱导结果：共诱导传代74代，诺氟沙星终浓度达32μg／ml，诺氟沙星对诱导株的最低抑菌浓度由0.125μg／ml上升到128μg／ml，是原来的1024倍。同时其他三种结构不同的抗生素TE、C、Am对其的最低抑菌浓度值也相应上升为原来的128、64、32倍，诱导菌株由敏感野生株逐步转变为多重耐药株。4．gyrA基因、parC基因PCR扩增：N8经诺氟沙星诱导得到的各代菌株全部分别扩增出648bp和469bp长度的片段，分别是gyrA和parC基因的扩增产物。5．gyrA基因、parC基因的单链构象多态性（PCR-SSCP）分析：对各代菌株研究，发现gyrA基因和parC基因分别呈现三种单链构象图谱，gyrA基因的突变可能发生在第12代和第55代，parC基因的突变可能发生在第21代和52代。6．突变菌株PCR产物的核酸序列分析：与N8原代的序列比较，gyrA基因在第12代即发生编码第87位氨基酸的单个碱基突变（GAC→TAC），在第55代发生了编码第221位氨基酸的碱基突变（GGA→GCA）；parC基因在第21代发生编码第80位氨基酸的碱基改变（AGC→AGA），在第52代又有编码第84位氨基酸的碱基改变（GAA→GCA）。7．CCCP对受试菌MIC的影响：加入能量抑制剂CCCP后，敏感菌与耐药菌的MIC均有不同程度的降低。结论1．本研究从基因突变时序和耐药程度的变化直接证实压力环境与细菌形成耐药的关系，为药物选择性——基因突变——耐药形成理论提供直接的科学依据。2．GyrA可能是喹诺酮类药物作用的第一靶位，ParC可能是第二靶位。耐喹诺酮类药物程度不同的菌株，其靶基因突变数量、涉及靶酶范围不同。耐药株靶基因突变存在多态性。3．诱导株多重耐药性的产生可能是由于激活了它的包括AcrAB在内的主动外排系统。主动外排机制和靶基因突变共同存在导致志贺菌属细菌耐喹诺酮类药物。