目的：蝙蝠葛碱(dauricine,Dau)和蝙蝠葛苏林碱(daurisoline,DS)是从中药蝙蝠葛(Menisperum dauricum,DC)根茎中提取的双苄基异喹林类生物碱。近年来,研究发现Dau和DS均具显著的抗实验性心律失常作用。长QT综合征(Long QT syndrome,LQTs)的基础是心肌细胞复极延缓。正常心肌细胞的动作电位复极时程和形态受外向电流和内向电流的影响。外向电流主要为快速激活延迟整流钾电流(rapidly activated delayed recitifying potassium current,IKr)和缓慢激活延迟整流钾电流(slowly activated delayed rectifying potassium current,IKs).内向电流主要为钠电流(sodium current,INa).L型钙通道电流(L-type calciumcurrent,ICa-L)。本研究采用膜片钳和Western blotting技术,研究Dau和DS对与获得性LQTs相关离子通道的影响规律,并在离子通道和蛋白水平探讨Dau和DS抗心律失常的作用机制。方法：1.采用酶消化法分离家兔左心室单个心肌细胞,用膜片钳技术,在电压钳制模式下记录单个细胞IK1、IKr、IKs和Ito,研究Dau和DS对心室肌细胞IK1、IKr、IKs和Ito的影响。2.用膜片钳技术记录在人胚肾细胞(HEK293)表达的hERG通道电流,研究Dau和DS对hERG通道电生理特性的影响,并与Quin和AM相比较。3.用Western blotting方法研究Dau和DS对hERG通道蛋白的影响。结果：1.以家兔单个心室肌细胞为研究对象,研究Dau和DS对IK1、IKr、IKs和Ito通道电流的影响(1)Dau：与给药前相比,Dau1,3,10,30,100μmol·L-1对IK1具有一定抑制作用,但差异均无统计学意义(P>0.05),对翻转电位也无影响(-40mV)。在-100 mV测试电压下,Dau 10,30,100μmol·L-1对IK1的抑制率分别为(5.8±1.8)%、(16.5±2.7)%和(39.3±8.1)%。在+60mV测试电压下,Dau 1,3,10,30μmol·L-1对Iκr的抑制率分别为(12.2±8.6)%、(30.4±7.1)%、(37.1±3.7)%和(64.1±5.8)%,半数抑制浓度(IC50)为14.0μmol·L-1。Dau 10μmol·L-1, 30μmol·L-1使IKr半激活电压由(-16.4±2.8)mV变为(-14.8±2.2)、(-17.8±4.2)mV变为(-20.7±1.7),曲线斜率由6.2±0.1变为6.8±0.4、6.2±0.2变为6.5±0.2,差异均无统计学意义(P>0.05)。在+60mV测试电压下,Dau 10,30μmol·L-1对IKs的抑制率分别为(28.7±3.3)%和(40.3±5.2)%。Dau 10,30μmol·L-1使IKs半激活电压由(14.1±0.7)mV变为(12.8±1.6)mV、(15.0±1.9)mV变为(10.5±1.0)mV,曲线斜率由6.2±0.2变为6.5±0.2、14.7±0.7变为15.5±1.7,差异均无统计学意义(P>0.05)。Dau 10,30,100μmol·L-1的对Ito电流均有抑制作用。在+30 mV测试电压下,Dau 30,100μmol·L-1对Ito的抑制率分别为(26.5±3.6)%和(38.7±0.7)%。Dau 30,100μmol·L-1使Ito半激活电压由(-12.4±4.6)mV变为(17.1±1.9)mV、(-12.5±4.6)mV变为(-14.0±3.2)mV,曲线斜率由19.9±1.4变为20.4±0.2、19.9±1.4变为19.8±0.7,差异均无统计学意义(P>0.05)。(2)DS：与给药前相比,DS 10,30,100μmol·L-1对IK1具有一定抑制作用,差异均无统计学意义(P>0.05),对翻转电位也无影响(-40 mV)。在-100 mV测试电压下,DS 10,30,100μmol·L-1对IK1的抑制率分别为(8.0±2.8)%、(16.0±3.4)%和(26.1±8.5)%。在+60 mV测试电压下,DS 1,3,10,30μmol·L-1对IKr的抑制率分别为(6.7±1.9)%、(26.1±6.0)%、(31.1±5.0)%和(55.4±6.9)%,IC50为19.9μmol·L-1。DS 10,30μmol·L-1使IKr半激活电压由(-22.5±1.1)mV变为(-25.2±1.5)mV、(-21.5±1.6)mV变为(-26.5±3.2)mV,曲线斜率由6.6±0.2变为5.6±0.4、6.7±0.4变为4.7±1.1,差异均无统计学意义(P>0.05)。在+60mV测试电压下,DS 10,30μmol·L-1对IKs的抑制率分别为(25.7±3.8)%和(38.0±3.8)%。DS 10,30μmol·L-1使Iκs半激活电压由(12.0±3.8)mV变为(11.5±1.7)mV、(12.2±3.0)mV变为(7.3±3.3)mV,曲线斜率由13.5±0.8变为12.3±1.3、13.9±0.9变为13.9±1.9,差异均无统计学意义(P>0.05)。DS 10,30μmol·L-1对Ito尾电流均有抑制作用。在+30 mV测试电压下,DS 10,30μmol·L-1对Ito的抑制率分别为(6.1±9.2)%和(36.5±11.4)%。DS 10,30μmol·L-1使Ito半激活电压由(-10.9±4.8)mV变为(-9.0±4.3)mV、(-19.9±1.9)mV变为(-15.7±1.5)mV,曲线斜率由17.0±1.5变为18.0±1.5、18.4±1.5变为17.6±1.8,差异均无统计学意义(P>0.05)。2.以HEK293细胞上表达的hERG通道为研究对象,研究Dau和DS对hERG通道动力学的影响(1)Dau：在20 mV时,Dau 1,3,10,30μmol·L-1对hERG去极化末电流的抑制率(16.1±5.5)%、(28.4±6.7)%(P<0.05,n=8)、(59.7±8.9)%(P<0.05,n=10)、(79.7±4.7)%(P<0.05,n=7),IC50为6.9μmol·L-1;在60mV时,对hERG尾电流的抑制率分别是(6.1±5.2)%、(26.5±3.6)%(P<0.05,n=4)、(57.6±8.8)%(P<0.05,n=9)、(85.3±2.2)%(P<0.05,n=6),IC50为8.4μmol·L-1。Dau1,3,10,30μmol·L-1分别使hERG的半激活电压V1/2从(4.5±3.0)mV变为(3.3±3.3)mV、(5.1±2.9)mV变为(2.6±4.0)mV、(0.7±2.8)mV变为(-6.2±5.8)mV、(1.1±2.7)mV变为(3.7±4.1)mV,差异均无显著性；激活曲线斜率分别从10.6±0.6变为11.0±0.7、10.7±0.6变为11.2±0.8、9.9±0.4变为13.6±1.6、9.6±0.4变为17.1±1.9(P<0.05)。Dau 10μmol·L-1分别使hERG的半失活电压V1/2从(-52.7±3.7)mV变为(-57.8±3.5)mV(P<0.05,n=11)；失活曲线斜率从-21.7±0.6变为-21.0±0.5(n=9,P>0.05)。单指数方程拟合稳态失活电流得到失活时间常数,在-120 mV和-110 mV电压下,Dau 10μmol·L-1使稳态失活时间常数明显下降,失活速率加快(P<0.05)。Dau对瞬时失活曲线和恢复时间常数无影响。Dau具有开放性阻断剂的特性。(2)DS：在20mV时,DS 1,3,10,30μmol·L-1对hERG去极化末电流的抑制率分别是(32.2±4.2)%(n=6,P<0.05)、(41.6±2.6)%(n=4,P<0.05)、(62.1±5.9)%(n=12,P<0.05)、(74.8±9.8)%(n=5,P<0.05),IC50为9.1μmol·L-1;在60 mV时,对hERG尾电流的抑制率分别是(16.7±5.8)%(n=6)、(31.1±4.5)%(n=7,P<0.05)、(55.1±11.2)%(n=13,P<0.05)、(81.2±7.0)%,IC50为9.6μmol·L-1。DS 1,3,10,30μmol·L-1分别使hERG的半激活电压V1/2从(8.2±2.0)mV变为(7.6±3.2)mV、(4.7±3.4)mV变为(6.5±3.1)mV、(2.8±3.3)mV变为(-2.6±4.2)mV、(0.4±4.5)mV变为(2.5±4.9)mV；激活曲线斜率分别从10.0±0.6变为11.1±0.8、10.5±0.7变为11.1±1.1、10.5±0.7变为13.2±2.2、10.0±0.7变为12.7±1.6,差异均无显著性。DS 10μmol·L-1分别使hERG的半失活电压V1/2从(-48.7±7.6)mV变为(-64.6±5.2)mV(P<0.05)；失活曲线斜率从-21.9±0.7变为-22.5±1.0,差异无显著性。在-120mV到-100mV电压下,DS 10μmol·L-1使稳态失活时间常数明显下降,失活速率加快(P<0.05)。DS 10μmol·L-1在-50 mV至+10 mV电压下对瞬时失活曲线有影响(左移),在-20 mV至+10 mV电压下瞬时失活时间常数缩短,差异有统计学意义。DS具有开放性阻断剂的特性。3.以HEK293细胞上表达的hERG通道为研究对象,采用Western blotting技术,研究Dau和DS对hERG通道蛋白表达水平的影响(1)Dau:HEK293-hERG细胞孵育24 h后,在大部分指令电压下Dau 10μmol·L-1可增加hERG尾电流(Itail),但无统计学差异。control组的膜电容为(32.4±4.4)pF(n=17),Dau 10μmol·L-1组膜电容为(35.9±4.7)pF(n=15),差异无统计学意义。分别用Dau 3,10,30μmol·L-1处理细胞24 h后进行Western blotting检测,结果发现Dau 30μmol·L-1可减少hERG通道蛋白的表达,统计学上有显著差异(P<0.05)。(2)DS:HEK293-hERG细胞孵育24 h后,DS 10μmol·L-1可抑制hERG去极化末电流(Istep),在-60 mV至0 mV差异有统计学意义(P<0.05)。在所有电压下对尾电流(Itail)均有抑制作用,差异有显著性(P<0.05)。control组的膜电容为(16.5±3.1)pF(n=12)，DS 10μmol·L-1组膜电容为(45.7±9.4)pF(n=6),差异有统计学意义(P<0.05)。分别用DS 3,10,30μmol·L-1处理细胞24h后进行Western blotting检测,结果发现DS 30μmol·L-1可减少hERG通道蛋白的表达,统计学上有显著差异(P<0.05)。结论：1.Dau和DS对IK1和Ito均有一定抑制作用,但作用较弱,100μmol·L-1时抑制率均未达到50%。Dau对IKr尾电流半数抑制浓度为14.0μmol·L-1,DS对IKr尾电流半数抑制浓度为19.9μmol·L-1,对IKr的激活曲线、半激活电压和激活曲线斜率的影响,均无统计学意义。Dau和DS对IKs尾电流的抑制作用较IKr弱,30μmol·L-1时抑制率均未达到50%。2.Dau、DS对hERG通道具有抑制作用,该作用具有电压依赖性,随着膜电位的去极化,抑制作用逐渐增强。但Dau和DS对通道的激活曲线几乎无影响。Dau.DS均能使hERG通道的半失活电压下降,失活时间常数减小,失活速率加快。Dau对瞬时失活曲线和恢复时间常数无影响。DS瞬时失活曲线左移,-20 mV-+10 mV电压下瞬时失活时间常数缩短,不影响恢复时间常数。Dau和DS对hERG通道的抑制作用具有开放性阻断剂的特征。3.hERG细胞在Dau 10μmol·L-1孵育24 h后,去极化末电流和尾电流都有增加的趋势,hERG通道蛋白表达减少,但均无统计学差异,Dau 30μmol·L-1时可显著减少hERG蛋白的表达。DS 10μmol·L-1孵育24 h后,在所有指令电压下尾电流都减小,有统计学差异,但DS 10μmol·L-1对hERG表达无显著影响,在30μmol·L-1时可显著减少hERG蛋白的表达。