基于胚胎干细胞定向诱导神经分化模型评价bFGF对神经发育作用的影响

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目的:建立小鼠胚胎干细胞定向分化为神经细胞离体实验模型,探讨不同浓度的碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)对小鼠神经发育过程的影响。方法:(1)将ESC形成的EB使用5×10-7mol/L维甲酸(ratinoic acid,RA)进行悬浮诱导2天,之后换用ITS培养基,诱导OG2小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)向神经细胞定向分化,并通过形态学观察、免疫荧光和定量PCR等方法,用于ESC向神经细胞分化的鉴定;(2)将ESC来源的神经细胞暴露于不同浓度的bFGF和VPA15天后,用CCK8法检测测定物bFGF和阳性对照药物丙戊酸(valproic acid, VPA)的神经毒性作用;(3)将ESC来源的神经细胞暴露于不同浓度的bFGF15天后,Q-PCR定量分析法检测测定物bFGF和VPA对神经特异性标记基因表达的影响,并用蛋白印记方法验证Q-PCR结果的准确性和一致性;(4)将ESC来源的神经细胞暴露于不同浓度的bFGF15天后,流式细胞术和Hoechost染色等方法测定bFGF在非细胞毒性剂量下对神经分化细胞凋亡等影响。结果:(1)成功建立胚胎干细胞定向分化为神经细胞的模型。形态学观察、免疫荧光和定量PCR等方法用于ESC向神经细胞分化的鉴定结果表明,所诱导分化形成的神经细胞具有神经细胞特征,可用于bFGF神经作用及其毒性的实验研究。(2)验证神经细胞定向分化模型用于评价待测物神经发育毒性的有效性。用所建立神经细胞定向分化模型,检测已知胚胎毒性药物丙戊酸(VPA)对已分化神经细胞的毒性及ES细胞向神经细胞分化过程神经组织特异性基因的影响,以验证所建立的干细胞神经诱导分化模型的可用性。结果表明,VPA的IC50=103μg/mL,对神经组织特异性基因影响的结果与文献研究结果类似,表明该诱导分化模型可用于神经发育毒性的检测。(3)bFGF对小鼠胚胎干细胞神经发育过程的影响。用所建立的神经细胞分化模型,检测bFGF对神经发育过程的影响,结果表明,bFGF的IC50=9.6μg/mL;0.1μg/mL bFGF可诱导神经元分化和成熟;1μg/mLbFGF主要促进神经前体细胞的生长,提高mES-NPC的增殖能力;10μg/mL bFGF为促进神经元细胞的生长。在所试验浓度范围内,未见对神经分化细胞造成明显毒性表现。(4)所用剂量bFGF未发现具有诱发神经细胞凋亡及氧化应激损伤毒性。结论:本研究建立小鼠胚胎干细胞定向分化为神经细胞实验模型,探讨不同浓度的bFGF对小鼠神经发育过程的影响。研究结果表明,bFGF在0.1-10μg/mL范围内,主要表现为诱导神经元分化和成熟,增强mESC-NPC的增殖能力,以及促进神经元细胞的生长。未见到bFGF对神经细胞的明显毒性,表明bFGF在常用浓度条件和高剂量下使用相对安全。
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