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裂殖壶菌(Schizochytrium)是一种单细胞异养微藻,由于胞内可积累高安全性、高纯度的油脂,被认为是目前工业化生产二十二碳六烯酸(Docosahexaenic acid,DHA)最理想的菌株之一。裂殖壶菌的生长过程可分为细胞生长、脂质积累和脂质反耗三个阶段,脂质反耗可以促进胞内脂肪酸的迁移,尤其是DHA的富集。裂殖壶菌胞内脂肪酸的积累受碳源的影响较大,研究不同碳源发酵条件下裂殖壶菌脂肪酸的迁移规律对后期调控发酵策略优化裂殖壶菌的产脂品质具有重要意义。本课题以裂殖壶菌Schizochytrium sp.S31为研究对象,采用了多种方法分析其胞内的脂质组成,并利用脂质组学方法研究了其在不同碳源发酵条件下脂肪酸的迁移规律,最后结合分子生物学手段对涉及脂肪酸迁移的关键脂肪酶进行了探索,以期为提升裂殖壶菌藻油DHA品质提供理论依据和新思路。首先,分析了裂殖壶菌胞内的脂质组成。裂殖壶菌油脂主要由中性脂质(74.83%)、极性脂质(2.69%)和糖脂(22.68%)组成。其中,中性脂质最主要的组分是甘油三酯(93.81%),还包括少量的甘油二酯(2.93%)和甘油一酯(2.86%)。气相色谱分析结果显示,棕榈酸和DHA是各脂质组分中主要的脂肪酸,DHA在中性脂中的含量较高。此外,利用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用(UPLC-Q-To F-MS)从裂殖壶菌油脂中共鉴定出80余种甘油三酯,含量相对较高的为22:6-22:6-16:0和18:1-22:6-14:0。其次,对比研究了裂殖壶菌分别在葡萄糖和甘油为碳源条件下胞内脂肪酸的迁移规律。脂质反耗阶段,两种发酵模式下的生物量和脂质含量均会下降,但以甘油为碳源时,脂肪酸的迁移现象更明显。其中,棕榈酸含量由反耗前的41.18%降低至反耗后的21.33%,DHA则由31.20%上升至50.43%。脂肪酸合成酶(FAS)产物下降幅度为28.23%,而聚酮合成酶(PKS)产物上升幅度达29.45%。甘油三酯变化规律表明发酵前期14:0-14:0-16:0、14:0-16:0-16:0和16:0-16:0-16:0会优先积累,其在反耗阶段的优先水解会促进16:0-22:6-22:6、16:0-22:6-22:5、22:6-22:6-22:6和22:6-22:6-22:5的富集。结合偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)共鉴定出用于区分两种碳源模式的4种脂质标记物。最后,进一步运用生物信息学方法筛选裂殖壶菌在反耗阶段参与胞内脂肪酸迁移的关键脂肪酶基因STGL1。基因STGL1全长为2885 bp,编码的脂肪酶Stgl1p共含用961氨基酸。Stgl1p与酿酒酵母中特异性水解中长碳链饱和脂肪酸的脂肪酶Tgl4p氨基酸序列相似度达34%,尤其是在氨基酸326-569的区间具有较高的保守性,且均含有脂肪酶共有特征保守序列GSSAG。结合利用分子生物学手段,成功构建了脂肪酶基因STGL1的毕赤酵母GS115表达载体。经甲醇诱导48 h后,STGL1在重组菌株体内实现了表达。进一步结合脂肪酶定性检测平板和高效液相色谱分析,证实了重组菌株分泌的Stgl1p脂肪酶具有水解橄榄油的活性。