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研究背景乳腺癌与宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤,严重威胁着女性的健康。近年的研究发现,在包括乳腺癌和宫颈癌在内的许多恶性肿瘤中巨噬细胞集落刺激因子(Macrophage colony stimulating factor, M-CSF)的水平异常升高,而在其相应的癌旁组织或良性肿瘤中M-CSF的水平均正常或不易测出,提示血清中的循环M-CSF可能成为这些肿瘤的分子标记物,与这些恶性肿瘤的发生、发展密切相关。M-CSF,也称集落刺激因子-1(CSF-1),是细胞信号转导网络中由多种细胞产生的一种具有谱系特异性的细胞因子。有研究表明,M-CSF可能在许多肿瘤包括乳腺癌与宫颈癌的发生、发展过程中扮演重要角色,但对其作用尤其是机理的探讨较少。弄清M-CSF在乳腺癌、宫颈癌发生发展中的作用及其相关机制,通过基因治疗手段延缓或逆转乳腺癌、宫颈癌细胞的增殖和侵袭,将为探索乳腺癌、宫颈癌的防治提供一条新的思路。本课题拟从体内、体外试验并结合临床标本检验系统观察M-CSF的异常表达对乳腺癌、宫颈癌细胞增殖的影响,研究可能存在的相关机制,为探索乳腺癌、宫颈癌的发病机制和新药防治提供新思路。第一部分M-CSF在乳腺癌和宫颈癌组织中的表达目的检测妇科肿瘤乳腺癌和宫颈癌肿瘤组织及血清中M-CSF的表达改变。方法选取在所在单位附属医院行妇科手术治疗的乳腺癌和宫颈癌患者各10例,取手术切除的肿瘤组织和癌旁正常组织,经福尔马林固定,石蜡包埋,作石蜡切片,常规HE染色,用M-CSF一抗作免疫组化;分别取10例乳腺癌患者、10例宫颈癌患者和10例健康体检者空腹外周静脉血备做ELISA检测M-CSF水平,健康体检者为在院内体检正常者作对照组。结果在乳腺癌、宫颈癌组织中M-CSF表达丰富,癌旁正常组织中M-CSF几乎不表达。乳腺癌患者、宫颈癌患者和健康体检者的血清M-CSF水平均值分别为620.16、486.72和223.25pg/ ml,乳腺癌患者和宫颈癌血清M-CSF水平明显高于健康体检者(P < 0.05)。小结乳腺癌和宫颈癌中M-CSF高表达。第二部分高表达M-CSF的人宫颈癌HeLa细胞和乳腺癌MCF7细胞的构建及其对细胞增殖的影响为了研究高表达M-CSF的作用,我们构建真核细胞载体pCMV/nuc/ M-CSF和pCMV/cyto/myc-M-CSF,经稳定转染低表达M-CSF的HeLa或不表达M-CSF的MCF7两种细胞中,建立稳定表达细胞系。在细胞水平上,观察高表达M-CSF对细胞增殖的影响。第一节高表达M-CSF的人宫颈癌HeLa细胞和乳腺癌MCF7细胞的构建及鉴定目的我们选择了HeLa和MCF7两种细胞,用靶向定位表达载体,通过脂质体转染细胞,分别建立胞核和胞质稳定高表达M-CSF的细胞系,旨在探讨胞核和胞质高表达的M-CSF对细胞活动的影响。方法构建重组载体pCMV/nuc/M-CSF和pCMV/cyto/myc-M-CSF,通过琼脂糖电泳、PCR扩增、SalⅠ/NcoⅠ双酶切及测序鉴定。然后将两种载体分别转染人宫颈癌HeLa细胞和乳腺癌MCF7细胞、G418筛选后,经RT-PCR,western印迹和免疫荧光鉴定M-CSF的mRNA表达、蛋白表达及定位。结果通过琼脂糖电泳、质粒PCR、双酶切及测序鉴定,表明pCMV/nuc/M-CSF和pCMV/myc/cyto-M-CSF载体已成功构建。通过脂质体将pCMV/nuc/M-CSF载体转染HeLa细胞和MCF7细胞,经G418筛选,并由RT-PCR、western印迹和间接免疫荧光实验证实,获得的转染细胞不仅高表达M-CSF mRNA,而且能高表达M-CSF蛋白,并且定位于细胞核中。将pCMV/myc/cyto-M-CSF载体通过脂质体转染HeLa细胞和MCF7细胞,获得的转染细胞不仅高表达M-CSF mRNA,而且能高表达M-CSF蛋白,并且定位于细胞质中。小结成功构建了M-CSF靶向定位蛋白表达载体pCMV/nuc/M-CSF和pCMV/myc/cyto-M-CSF;成功建立了胞核稳定高表达M-CSF的HeLa细胞系和MCF7细胞系;成功构建了胞质稳定高表达M-CSF的HeLa细胞系和MCF7细胞系。第二节高表达的M-CSF对HeLa细胞和MCF7细胞增殖的影响目的观察胞核和胞质高表达的M-CSF细胞系对细胞增殖的影响。方法采用已建立的pCMV/nuc/M-CSF和pCMV/myc/cyto-M-CSF分别转染的HeLa细胞系和MCF7细胞系及空载体转染和未转染的细胞,通过计算细胞倍增时间、MTT法及反义寡核苷酸抑制实验分析M-CSF对细胞增殖的影响。结果与未转染M-CSF和转染空载体的MCF7细胞相比,胞质转染M-CSF和胞核转染M-CSF的MCF7细胞倍增时间均明显缩短,增殖能力均显著增强(n=3,P<0.05),M-CSF的特异性反义寡核苷酸能抑制转染M-CSF的MCF7细胞的增殖,且抑制率随着反义寡核苷酸浓度的增高而增强。在HeLa细胞,我们也获得了相近的结果,即胞质转染M-CSF和胞核转染M-CSF的HeLa细胞倍增时间均明显缩短,增殖能力均显著增强(n=3,P<0.05),M-CSF的特异性反义寡核苷酸能抑制转染M-CSF的HeLa细胞的增殖,且抑制率随着反义寡核苷酸浓度的增高而增强。小结胞质、胞核高表达M-CSF可促进HeLa细胞和MCF7细胞的增殖。第三部分裸鼠移植瘤实验观察M-CSF对裸鼠移植瘤生长的影响目的通过裸鼠移植瘤实验观察M-CSF对裸鼠移植瘤生长的影响。方法无菌条件下,裸鼠随机分为10组,每组5只,分别背部皮下接种转染pCMV/nuc/M-CSF、pCMV/myc/cyto-M-CSF、未转染的和转染空质粒pCMV/nuc/myc和pCMV/myc/cyto的HeLa细胞及MCF7细胞,各2×106 cells/只,以皮下结节直径> 0.5 mm3为成瘤标准。观察各组荷瘤鼠皮下移植瘤成瘤时间、瘤体积和瘤重的差异。结果与未转染的和转染空质粒的HeLa细胞接种裸鼠比较,接种转染pCMV/nuc/M-CSF和pCMV/myc/cyto-M-CSF的HeLa细胞形成的肿瘤成瘤时间较早,瘤体积和瘤重明显增大( P<0.05),与未转染的和转染空质粒的MCF7细胞接种裸鼠比较,接种转染pCMV/nuc/M-CSF和pCMV/myc/cyto-M-CSF的MCF7细胞形成的肿瘤成瘤时间较早,瘤体积和瘤重明显增大( P<0.05)。小结高表达M-CSF可促进HeLa细胞和MCF7细胞在裸鼠移植瘤的生长。第四部分细胞内M-CSF促进HeLa细胞和MCF7细胞增殖的可能机制研究目的分析M-CSF促进HeLa细胞和MCF7细胞增殖的可能机制。方法Western blot检测各组细胞cyclinD1、p38、p-p38、Akt、p-Akt的表达,并加入抑制剂组检测表达情况,NBT还原比色实验检测各组细胞NAPDH氧化酶的活性。结果无论是MCF7细胞还是HeLa细胞,胞质转染M-CSF组和胞核转染M-CSF组cyclinD1的蛋白表达均较未转染组和空质粒转染组明显增强(P<0.05),NAPDH氧化酶的活性增高。胞核转染M-CSF的MCF7细胞组p-p38和p-Akt的表达较未转染组和空质粒转染组明显增强,胞质转染M-CSF的HeLa细胞组p-p38和p-Akt的表达较未转染组和空质粒转染组也明显增强。小结高表达M-CSF促进HeLa细胞和MCF7细胞增殖的机制可能与通过NAPDH氧化酶活化p38 MAPK和PI3K途径,促进cyclin D1的表达有关。结论1.M-CSF在乳腺癌和宫颈癌中高表达;2.高表达M-CSF可促进HeLa细胞和MCF7细胞增殖;3.高表达M-CSF可促进HeLa细胞和MCF7细胞在裸鼠移植瘤的生长;4.促进细胞增殖的机制可能与通过NAPDH氧化酶活化p38 MAPK和PI3K途径,促进cyclin D1的表达有关。